超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定植物性食品中阿維菌素類藥物殘留*

羅成玉 查玉兵 /

1. 上海市浦東新區(qū)計量質(zhì)量檢測所；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所

0 引言

阿維菌素類藥物(Avemreetins，AVMS)，是由鏈霉菌產(chǎn)生的一組大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[1]，該類農(nóng)藥具有殺蟲譜廣、殺蟲活性高、易與多數(shù)農(nóng)藥混配使用等優(yōu)點。阿維菌素類農(nóng)藥已廣泛應用在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，是我國目前使用范圍最廣的殺蟲劑之一[2]。

阿維菌素類藥物分析方法已有許多報道，大多是采用高效液相色譜法，所用的檢測器主要為紫外檢測器[3-5]和熒光檢測器[6-8]。用紫外檢測器測定阿維菌素類藥物時，靈敏度太低。用熒光檢測器測定時能從很大程度上提高靈敏度，但是測定前要對該類藥物衍生化，衍生化步驟繁瑣，而且衍生化產(chǎn)物不穩(wěn)定，所以該方法的應用也有很大的局限性。本方法采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定植物性食品中阿維菌素類藥物殘留，避免了紫外檢測器和熒光檢測器的缺點，不僅簡化了前期處理步驟，而且大大提高了方法的檢出限。

1 實驗

1.1 儀器、試劑與材料

Waters UPLC-TQD超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；高速均質(zhì)機；氮吹儀（美國Organomation）；離心機（日本日立）；漩渦混合器（德國IKA）；固相萃取裝置(HP6019)；電子天平（FA1104，上海天平儀器廠）。

甲醇（色譜純）；甲醇（分析純）；乙腈（分析純）；二氯甲烷（分析純）；水為二次蒸餾水；堿性氧化鋁固相萃取小柱（2 g/12 mL）；炭黑氨基固相萃取小柱（500 mg/6 mL）；阿維菌素類藥物標準品（＞95%）。

標準品溶液的制備：分別稱取10 mg的阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽和乙酰胺基阿維菌素標準品，用甲醇溶解于100 mL容量瓶中，4 ℃下保存。

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件

UPLC ACQUITY BEHC18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：A為乙腈，B為0.1 %乙酸+5 mmol/L乙酸銨)，B為甲醇；梯度洗脫程序為：0～ 2.5 min，40%A；3 ～ 5 min， 90%A；5 ～ 7 min，40%A保持1 min。流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI，正離子模式；毛細管電壓：4.0 kV；離子源溫度：105 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流量：800 L/ h；錐孔反吹氣流量50 L/ h；錐孔電壓：40 V；掃描方式：多反應監(jiān)測（MRM）。

1.3 分析步驟

1.3.1 提取

1.3.1.1 蔬菜、水果類

稱取25 g試料，精確至0.01 g，于100 mL燒杯中，加入50 mL乙腈，組織勻漿機勻漿2 min，過濾至裝有7 g氯化鈉的具塞量筒中，收集全部濾液，劇烈振蕩2 min，靜置10 min。待乙腈相和水相分層后，取上層乙腈相10 mL于15 mL具塞試管中，置于50 ℃水浴氮吹至3 ～ 5 mL，備用。

1.3.1.2 糧谷類

稱取5 g試料，精確至0.01 g，用5 mL水將試料潤濕，放置5 min，加入15 mL乙腈，漩渦混合器渦動3 min，超聲波儀超聲5 min，加入5 g無水硫酸鈉，漩渦混合器渦動1 min，離心機5 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至濃縮瓶中。用10 mL乙腈再提取一次，合并提取液。將提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，50 ℃下濃縮至 3 ～ 5 mL，備用。

1.3.1.3 油料作物

稱取5 g試料，精確至0.01 g，用5 mL水將試料潤濕，放置5 min，加入15 mL乙腈，漩渦混合器渦動3 min，超聲波儀超聲5 min，加入5 g無水硫酸鈉，漩渦混合器渦動1 min，離心機5 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至濃縮瓶中。用10 mL乙腈再提取一次，合并提取液。將提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，50 ℃下濃縮至3 ～ 5 mL，將濃縮液轉(zhuǎn)移至20 mL離心管中，加3 mL乙腈飽和的正己烷，渦動，靜置分層后棄去正己烷層。在乙腈相中再加3 mL乙腈飽和的正己烷，渦動，靜置分層后棄去正己烷層，乙腈相備用。根據(jù)油料作物的油脂含量來酌量增減去脂次數(shù)。

1.3.1.4 茶葉

稱取5 g試料，精確至0.01 g，用5 mL水將試料潤濕，放置5 min，加入15 mL乙腈，漩渦混合器渦動3 min，超聲波儀超聲5 min，加入5 g無水硫酸鈉，漩渦混合器渦動1 min，離心機5 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至濃縮瓶中。用10 mL乙腈再提取一次，合并提取液。將提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，50 ℃下濃縮至近干，在殘渣中加入2.0 mL甲醇+二氯甲烷溶液，備用。

1.3.2 凈化

1.3.2.1 蔬菜、水果、糧谷類和油料作物

將堿性氧化鋁柱用5 mL乙腈預洗后，將上述試料濃縮液過柱，自然流出，收集于10 mL具塞試管中。用5 mL乙腈分兩次洗滌試管并將洗滌液轉(zhuǎn)入堿性氧化鋁柱，收集全部流出液。將流出液置于50 ℃水浴中用氮氣吹干，用1.0 mL流動相溶解殘渣，渦旋混勻，過0.22 μm微孔濾膜，供超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3.2.2 茶葉

將炭黑氨基柱用4.0 mL甲醇+二氯甲烷溶液預條件化，加入上述試料濃縮液，用10 mL具塞試管收集，用2.0 mL甲醇+二氯甲烷溶液洗濃縮瓶后淋洗小柱，重復一次。將收集溶液置于50 ℃水浴中用氮氣吹干，用1.0 mL流動相溶解殘渣，渦旋混勻，過0.22 μm微孔濾膜，供超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法

2.1.1 提取溶劑的選擇

農(nóng)藥殘留分析中對使用的溶劑要求是非常高的，即要求提取回收率高、雜質(zhì)干擾小、經(jīng)濟、環(huán)境友好等。阿維菌素類藥物屬于弱極性物質(zhì)，易溶于甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙腈等有機溶劑，微溶于正己烷和石油醚，在水中的溶解度極低。本文考察了丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈4種提取溶劑對添加回收率的影響。結(jié)果表明：用乙酸乙酯和乙腈作為提取溶劑均能獲得較高的添加回收率。用乙酸乙酯提取時，樣品中的雜質(zhì)也會隨目標物一起被提取，這些雜質(zhì)會影響目標物的分離和定量分析。乙腈的提取效率高，雜質(zhì)干擾小，所以最終選擇乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 凈化條件的選擇

提取液中含有大量的雜質(zhì)，所以需要選擇一種合適的凈化方法來去除雜質(zhì)，本試驗研究比較了不同固相萃取小柱和不同性質(zhì)、不同比例的淋洗液和洗脫液對添加回收的影響。比較了C18小柱、中性氧化鋁小柱、堿性氧化鋁小柱和氨基柱的凈化效果。結(jié)果表明，對于蔬菜、水果類植物性食品，將其提取液過堿性氧化鋁小柱就可得到較理想的精華效果和回收率；不同的去脂次數(shù)對于樣品凈化結(jié)果影響很明顯，對于含油量較低的植物性食品用乙腈飽和的正己烷凈化兩次再過柱即可達到較好的凈化效果，而對于含油量較高的植物性食品用乙腈飽和的正己烷凈化三次再過柱才能達到較好的凈化效果。對于茶葉樣品，由于茶葉中含有大量的色素，經(jīng)上述各種小柱凈化后仍有大量的雜質(zhì)干擾，所以考慮用炭黑氨基柱凈化。結(jié)果表明，炭黑氨基柱不僅能較好地去除雜質(zhì)，而且能保證阿維菌素類藥物有較高地吸附。所以本實驗中蔬菜、水果和糧油類作物采用堿性氧化鋁小柱，對于茶葉樣品采用炭黑氨基柱。

2.2 液相色譜、質(zhì)譜測定條件的優(yōu)化

阿維菌素類藥物的極性較弱，在反相色譜柱上的保留較強，因此選擇較高比例的乙腈作為強洗脫溶劑。母離子掃描顯示：阿維菌素類藥物在正離子模式下，目標物檢測離子以[M+NH4]+形式存在的量較多，在流動相中加入5 mmol/ L乙酸銨可促進母離子的形成,同時在流動相中加入0. 1 %的乙酸來增強待測物的離子化。5種阿維菌素類藥物的定量離子、定性離子、錐孔電壓及碰撞能量見表1。

表1 各目標化合物的檢測離子及質(zhì)譜采集參數(shù)

2.3 方法的標準曲線與檢出限

用流動相準確配置1、10、50、100、200 ng/mL的標準工作溶液。在上述儀器測定條件下進行分析，以被測組分峰面積Y對其質(zhì)量濃度（X）作工作曲線。結(jié)果表明，在1 ～ 200 ng/mL范圍內(nèi)，5種阿維菌素類藥物標準工作溶液的色譜峰面積與質(zhì)量濃度成良好的線性關(guān)系，回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表2。根據(jù)10倍信噪比計算定量限，5種藥物的定量限均為1.0 μg/kg，能滿足日本、歐盟等規(guī)定的最大殘留限量的檢測要求。

表2 各目標化合物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)

2.4 方法的準確度

選擇五大類沒有阿維菌素類殘留的具有代表性的樣品（小白菜、蘋果、大米、大豆和茶葉）做空白，同時設置三個不同的添加水平（4 μg/kg、20 μg/kg和100 μg/kg）。分別計算添加回收率及其相對標準偏差。所得添加回收率在80.6 % ～ 99.8%，RSD分別為0.22 % ～ 6.4 %。表明該分析方法具有良好的準確性。

3 結(jié)語

本文建立了植物性食品中阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽和乙酰胺基阿維菌素殘留量的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法，考察了不同提取條件、凈化條件和質(zhì)譜條件。該方法能獲得較好的靈敏度、重復性和準確度。具有簡單、快速、適用性強的特點，適用于各類植物性食品中阿維菌素類藥物的測定。

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