不同散粉期胡桃楸離體花粉生活力的測定

王 非，趙舒野，姜思佳，張建瑛

(1.東北林業(yè)大學園林學院，哈爾濱 150040;2.黑龍江省森林植物園，哈爾濱 150040;3.黑龍江省林業(yè)科學研究所，哈爾濱 150040)

胡桃楸 (Juglans mandshurica)為胡桃科胡桃屬植物，落葉喬木，國家二級保護植物。胡桃楸不僅木材優(yōu)良，而且樹形優(yōu)美觀賞效果好，抗性和耐性都較強，可吸收工業(yè)廢氣是一種優(yōu)良的城市園林綠化樹種。此外，胡桃楸根、莖、葉、果實中含有豐富的化學活性成分，具有較強的抗腫瘤、抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗炎和抗菌等作用［1］。作為植物的雄配子體［2］，花粉生活力可作為評估花粉細胞活性的主要依據(jù)，其測定結(jié)果是否準確直接決定下一步的細胞學實驗和雜交授粉結(jié)實的成敗。目前國內(nèi)并未見到胡桃楸花粉活力測定的報道。本文開展胡桃楸花粉活力及萌發(fā)的研究，可為胡桃楸種質(zhì)資源保存、利用等實驗研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究地點與材料

實驗于2010年5月，在東北林業(yè)大學園林學院組織培養(yǎng)實驗室完成。

胡桃楸花粉采自東北林業(yè)大學實驗林場健康胡桃楸植株 (本實驗胡桃楸散粉期從2010年5月2日開始散粉，至5月7日散粉結(jié)束)。每天上午10∶00采集散粉期的雄花序，用硫酸紙包好，迅速帶回實驗室，將花序平攤在硫酸紙上，至避風陽光下晾曬，收集花粉，立即用于活力測定。

1.2 花粉生活力檢測

花粉活力檢測方法采用TTC法和I－KI法［3］。

1.3 花粉萌發(fā)實驗

配置濃度為10%、20%、30%、40%、50%和60%的6種蔗糖溶液，吸取少量溶液滴在載玻片上，取適量花粉撒在溶液中，將載玻片置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中。然后將培養(yǎng)皿放在恒溫箱中，24 h后進行觀察，取5個不同視野進行觀察，每個視野觀察不少于30個花粉粒。按公式 (1)計算萌發(fā)率。

花粉萌發(fā)率=(已萌發(fā)的花粉粒數(shù)÷花粉總粒數(shù))×100%。 (1)

1.4 不同散粉期花粉萌發(fā)率統(tǒng)計

在胡桃楸植株整個散粉初期→散粉盛期→散粉末期的過程中，每天采集新鮮的花粉，用TTC法和I－KI法進行活力測定，以及離體萌發(fā)法進行萌發(fā)率測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉生活力

2.1.1 TTC法檢測結(jié)果

在顯微鏡下觀察到偶有花粉粒著色，且著色較淡，不容易辨別，但隨著散粉時期的變化，著色率先升高后降低，可初步認為TTC法并不適用于胡桃楸花粉生活力檢測。

2.1.2 I－KI法檢測結(jié)果

在顯微鏡下觀察中幾乎沒有花粉著色。因為I－KI能將淀粉染成藍色，所以推測胡桃楸的花粉中積累的主要有機物質(zhì)不是淀粉，需要進一步進行組織化學成分分析來確定。I－KI法較TTC法檢測效果差，因此認為I－KI法也不適合胡桃楸花粉活力的測定。但隨著散粉時期的變化，著色率也呈先升高后降低趨勢。

2.2 花粉離體萌發(fā)觀察

2.2.1 花粉萌發(fā)蔗糖溶液濃度選擇

在離體培養(yǎng)基內(nèi)有關(guān)于蔗糖濃度配方的研究很多，一般認為10%～20%適宜，但是不同植物的花粉萌發(fā)需要的適宜培養(yǎng)基是不同的［4］。實驗結(jié)果顯示在蔗糖濃度為20%時，胡桃楸花粉的萌發(fā)率最高為81.52%見表1。

表1 不同蔗糖濃度中花粉的萌發(fā)率 (%)Tab.1 Pollen germination rate at different sucrose concentration

2.2.2 花粉萌發(fā)中的表現(xiàn)

顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)花粉呈3種形式:花粉管既不萌發(fā)或萌發(fā)較短，也不釋放內(nèi)含物如圖1(a)所示;花粉管不萌發(fā)，只釋放內(nèi)含物如圖1(b)所示;花粉管萌發(fā)并伸長如圖1(c)所示，只有花粉管萌發(fā)并伸長的類型才能被視為具有活力;可以見到花粉孔，由于觀察方向及花粉位置不同的原因，可以看到每個花粉有花粉孔3～7個不等如圖1(d)至圖1(f)所示。

圖1 顯微鏡下花粉的形式Fig.1 Pollen under the microscope

2.2.3 培養(yǎng)基萌發(fā)法測定不同散粉期花粉萌發(fā)率

記錄整個散粉周期 (5月2日至7日)，即時測定花粉的萌發(fā)率并繪制變化趨勢圖 (如圖1所示)。由表1和圖2可知，在整個散粉過程中，散粉初期 (5月2日，花粉的生活力最低只有81.52%，隨著散粉的進行，花粉的生活力升高至頂點 (5月6日)，然后，花粉的生活力開始下降，直至散粉終止 (5月7日)。其中5月6日是散粉量最大時期，即散粉盛期。

圖2 不同散粉期胡桃楸花粉萌發(fā)率Fig.2 Pollen germination rate at different pollen dispersal periods

3 結(jié)論與討論

本研究表明胡桃楸花粉生活力的測定方法主要是離體萌發(fā)法，最適宜的蔗糖濃度為20%，萌發(fā)率能達到81.52%，培養(yǎng)基制定較為簡便，有利于鏡檢;顯微鏡下，胡桃楸的花粉萌發(fā)主要有3種表現(xiàn)形式:花粉管既不萌發(fā)或萌發(fā)較短，也不釋放內(nèi)含物;花粉管不萌發(fā)，只釋放內(nèi)含物;花粉管萌發(fā)并伸長。除了蔗糖濃度外，硼酸濃度、Ca2+濃度、氣候條件以及實驗設(shè)備條件等也會影響花粉萌發(fā)，試驗僅為1年的觀察結(jié)果，因此該試驗只是對胡桃楸花粉活力的檢測進行了初步探索，其他培養(yǎng)條件還有待于進一步研究確定。在本研究中，采用離體培養(yǎng)基萌發(fā)法對胡桃楸不同散粉期花粉生活力進行了檢測，結(jié)果表明胡桃楸在散粉盛期時花粉的生活力較強。

前人關(guān)于花粉生活力檢測的研究已有很多報道，在本研究中，初步表明TTC法不適用于胡桃楸花粉生活力測定，這和很多植物的花粉活性測定研究的結(jié)果相似，如臘梅、桂花、木槿、海風藤等均不適用于 TTC 法［2，5－7］;I－ KI法測定胡桃楸的花粉生活力的效果也不明顯;而離體培養(yǎng)基萌發(fā)法是目前廣泛應用的1種檢測方法，檢測結(jié)果較為精確可靠［8］，花粉活力檢測指標為花粉萌發(fā)率，本實驗的結(jié)果顯示，胡桃楸花粉生活力檢測的方法為離體培養(yǎng)基法，但應該通過深入研究提高花粉生活力檢測的準確性。

【參 考 文 獻】

［1］管小玉，曲中原，鄒 翔等．胡桃楸的化學成分研究進展［J］．中草藥，2009，40(S):35 －38．

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［3］于曉英．瓜葉菊花粉生活力測定［J］．湖南農(nóng)業(yè)大學學報，2005(2):41－45．

［4］宋立功，周懷軍，王仁嫻，等．李樹不同品種花粉生活力研究［J］．河北林果研究，2006，(21)1:57 －62．

［5］楊秀蓮，向其柏．桂花花粉活力測定與‘晚籽銀’桂柱頭可授性分析［J］．林業(yè)科技開發(fā)，2007，(2l)3:22 －25．

［6］張辛華，李秀芬，張德順，等．木槿花粉活力檢測方法篩選［J］．中國農(nóng)學通報，2009，25(8):227 －229．

［7］郭 慶，王德斌，王定康，等．海楓藤花粉活力的測定方法比較［J］．昆明學院學報，2009，31(3):65 ～66．

［8］李志軍，丁 軍，徐崇志，等．胡楊灰葉胡楊花粉成分及生活力的比較研究［J］．武漢植物學研究，2002，20(6):453 －456．