柱后補償液相色譜與電霧式檢測器結合測定茶氨酸含量

趙 粼，闕 斐，周曉紅，劉綠葉

(1.浙江經貿職業(yè)技術學院應用工程系，浙江杭州310018;2.戴安中國有限公司上海實驗室，上海200210)

茶氨酸(theanine，N-乙基-γ-L-谷氨酰胺)是茶葉中特有的非蛋白氨基酸，具有舒緩神經抗疲勞等作用，常作為功能性成分添加到食品飲料中［1］。自1950年日本學者酒戶彌二郎首次從綠茶中分離茶氨酸以來，對于茶氨酸的定性、定量方法，已出現(xiàn)了堿式碳酸銅沉淀法、強酸性陽離子交換樹脂法、薄層色譜法、氣相色譜法和柱前衍生反相高效液相色譜法、直接進樣蒸發(fā)光散射檢測法、高效液相色譜質譜法等［2-8］。茶氨酸屬于紫外區(qū)末端吸收，也無熒光發(fā)射特性，采用低波長紫外檢測時干擾較大，因此，為了提高分析檢測的靈敏度和分離的選擇性，一般將茶氨酸進行衍生化，朱松等［2］采用OPA進行了柱前衍生后紫外檢測器測定，但通常這種方法對衍生試劑的要求高，操作復雜，分析成本也大大增加。為了減少繁瑣的衍生操作，李銀花等［4］報道了采用蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)來直接分析茶氨酸，但該方法通常靈敏度較低，線性范圍較窄，重現(xiàn)性差。本文采用一種新型的高靈敏度通用型檢測器-電霧式檢測器直接進樣分析，消除了溶劑等的干擾，以及溫度變化等引起的基線漂移，采用梯度洗脫與柱后補償進行分析，改善了分離度，降低了檢測限，提高了重現(xiàn)性，能準確進行定量分析，且由于電霧式檢測器響應因子一致原理，可以已知標準品對其他未知成分進行半定量分析，該方法具有簡單、易操作等特點。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶葉粗提物 共三批，由杭州茶葉研究院提供;茶氨酸標準品(純度＞97%)美國Sepulco公司;乙腈 色譜級，美國Merck公司;三氟乙酸(HPLC級)美國Fluka公司;去離子水 美國Millipore公司;其它未特別注明試劑均為分析純。

Ultimate DGP3600高效液相色譜儀(含雙三元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、Corona Ultra電霧式檢測器)美國Dionex公司;YB-630空氣壓縮機 上海勇霸有限公司。

1.2 標準溶液配制及樣品前處理

準溶液配制:稱取茶氨酸適量，用水超聲溶解，然后稀釋配制成不同濃度的標準工作溶液，4℃避光保存。最終工作溶液濃度為1.0、2.0、5.0、10、20、50μg/mL。

樣品前處理:準確稱取茶葉粗提物2.0g，用水稀釋定容至10mL，過0.45μm濾膜后，待進樣分析。

1.3 儀器分析條件

色譜柱:Acclaim PA2 C18(5μm，4.6mm ×250mm，120?)。流動相(左泵):A:三氟乙酸∶乙腈 =0.1∶100(V/V)，B:三氟乙酸∶水 =0.1∶100(V/V)，洗脫梯度:0～11min，A 為 100%，11～15min，A 由 100% ～60%，保持5min，然后 A立即回到100%，流速為0.5mL/min;補償流動相(右泵)，為100%乙腈，流速0.5mL/min，進樣體積:20μL，柱溫:25℃。

電霧式檢測器參數(shù)設置:采集頻率:5Hz;過濾模式:None;霧化溫度35℃;霧化氣壓力35.0psi;氮氣流速約4L/min。

2 結果與分析

2.1 色譜條件選擇

2.1.1 色譜柱與流動相的選擇［2-3］由于茶氨酸為強極性化合物，在普通C18反相柱上的保留時間較弱，在死時間處出峰，且普通C18柱通常都不能兼容100%水相，容易出現(xiàn)疏水塌陷。因此，本文選用戴安Acclaim PA2 C18極性官能團改性柱，可以兼容100%水相，同時，耐受較低的酸性環(huán)境。在本方法中，流動相中添加了0.1%三氟乙酸，增加了選擇性［3］，使得茶氨酸與其他化合物達到了基線分離。

2.1.2 采用柱后補償分析 由于電霧式檢測器同質譜儀等質量型檢測器一樣，也是基于霧化原理的檢測器，其響應值依賴于洗脫液的霧化效率，通過增加有機相比例，可以提高霧化效率，從而增加響應值，降低檢出限。同時，基于電霧式檢測器響應因子一致性的原理，在相同的有機相條件下，使得各化合物的響應更趨于一致，可以通過茶氨酸的含量對其他未知化合物進行半定量分析。因此，本方法中把DGP3600高效液相色譜儀左泵設置為分析泵，右泵設為補償泵，左邊的梯度洗脫程序為色譜分離條件，有機相從低到高;右泵為100%的乙腈，作為柱后補償流動相。

2.1.3 電霧式檢測器參數(shù)優(yōu)化 由于電霧式檢測器的原理及智能化設計，無需對多種參數(shù)進行優(yōu)化，本實驗僅對霧化溫度和采集頻率進行了優(yōu)化。當霧化溫度分別為25、30、35℃，目標化合物響應值略有增加，但基線噪音也隨之增加(見表1)，最后為了使霧化溫度與柱溫接近及綜合考慮，最后選擇30℃為霧化溫度;采集頻率分別使用2、5、10Hz進行實驗，同紫外檢測器一樣，采集頻率增加，基線噪音更明顯，同時，數(shù)據(jù)量也大大增加，最后在考慮了滿足峰形等要求下，選擇5Hz作為檢測器采集頻率。

表1 不同霧化溫度對茶氨酸響應值影響Table 1 The response of Theanine under different nebulization temperature

2.2 標準曲線與檢出限

取所配制的系列標準工作溶液，按1.3色譜條件測定a，標準品譜圖(濃度為10μg/mL)見圖1，茶氨酸保留時間為8.247min。以茶氨酸峰面積Y(pA×min)與其對應的濃度X(μg/mL)進行線性回歸分析，結果表明:線性方程為Y=0.1412X-0.0614，相關系數(shù) r=0.9998，線性范圍為1.0～50μg/mL，方法最低檢出限為 0.50μg/mL(以 S/N=3計)，定量限為1.50μg/mL(以S/N=10計)。

圖1 對照品色譜圖Fig.1 The chromatogram of standard

2.3 重現(xiàn)性與回收率實驗

重現(xiàn)性實驗，用同一標準品(10μg/mL)分別測定5次，計算得保留時間差小于0.2min，峰面積相對標準偏差(RSD值)為0.62%(n=5)，重現(xiàn)性較好。取3份空白樣品，分別添加 5.0、10.0、15.0μg/mL 標準工作溶液各1mL，按照“1.3”節(jié)分析測定條件，進行測定，結果見表 2，計算得回收率為 97.62%～112.13%，平均值為103.10%，RSD為0.48%～1.1%。

表2 空白樣品加標回收實驗Table 2 Spiked recoveries of a blank sample

2.4 樣品分析結果

按照“1.3”節(jié)分析測定條件，對三批樣品分別進行了三次平行測定，結果見表3。樣品分析譜圖見圖2。

表3 樣品檢測結果Table 3 The results of the sample

圖2 樣品色譜圖Fig.2 The chromatogram of sample

3 結論

本文采用最新型通用型檢測器-電霧式檢測器(CAD)對茶葉粗提物中的茶氨酸進行了分析，同時結合智能雙三元液相色譜系統(tǒng)進行梯度洗脫與柱后補償，取得了較好的分析結果。該方法最低檢出限為0.50μg/mL(以 S/N=3計)，定量限為1.50μg/mL(以S/N=10計);空白樣品加標回收率為97.62%～112.13%;重現(xiàn)性實驗表明(n=5)，茶氨酸的保留時間差值小于0.2min，峰面積的相對標準偏差(RSD值)為0.62%。此方法大大提高了方法的靈敏度，取得了較好的重現(xiàn)性與回收率結果，同時也避免了對茶氨酸進行衍生等復雜操作。

［1］肖偉濤，朱小蘭，陳波，等.制備高效液相色譜分離純化茶氨酸對照品［J］.中草藥，2004，35(2):148-150.

［2］朱松，王洪新.OPA柱前衍生高效液相色譜法測定茶氨酸的研究［J］.分析檢測，2005，26(2):17-19.

［3］劉小力，李想.茶葉中茶氨酸的含量方法測定研究［J］.食品科學，2009，30(14):281-284.

［4］李銀花，劉仲華，黃建安，等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器測定茶葉中茶氨酸［J］.茶葉科學，2005，25(2):225-228.

［5］郭升平.高效液相色譜法測定茶葉中茶氨酸的研究［J］.色譜，1996，14(6):463-465.

［6］朱小蘭，陳波，羅旭彪，等.高效液相色譜法測定茶葉中的茶氨酸［J］.色譜，2003，21(4):400-402.

［7］朱曙東，趙皓.氨基酸的高效液相色譜分析［J］.色譜，1994，12(1):20-23.

［8］Unno T，Suzuki Y，Kaduka T，et al.Metabolism of theanine，γ-glutamylethylamide in rats［J］.Journal of Agriculture and Food Chemistry，1999，47(4):1593-1596.