牛血液前處理方式對ELISA法檢測克侖特羅結(jié)果的影響

閔成軍，朱志盈，李小勇，金玉勝，武花鋒，文美英

(江蘇雨潤肉類產(chǎn)業(yè)集團有限公司，江蘇南京210041)

克侖特羅，異名克喘素、氨哮素，俗名“瘦肉精”，化學(xué)名為α-［(叔丁胺基)甲基］-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇鹽酸鹽［1-2］?？藖鎏亓_屬于β-興奮劑類藥物，在人醫(yī)和獸醫(yī)上用來治療哮喘。20世紀80年代初，美國Cyanamid公司意外發(fā)現(xiàn)將高于治療劑量5～10倍(即＞1g/kg·d)的克侖特羅添加于飼料飼喂動物后可明顯促進動物生長、改善胴體品質(zhì)、提高瘦肉率，克侖特羅作為一種非法飼料添加劑被許多專業(yè)飼養(yǎng)戶和飼料加工企業(yè)所使用，已經(jīng)成為了重大的食品安全問題［3-4］。90年代初期以來，出現(xiàn)多起克侖特羅中毒事件，并出現(xiàn)了死亡案例，因此被世界禁止使用。然而由于經(jīng)濟利益驅(qū)使，國內(nèi)許多不法養(yǎng)殖場仍非法使用。目前分析檢測克侖特羅的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)、酶聯(lián)免疫吸附檢測方法(ELISA)和免疫膠體金檢測方法［5-8］。經(jīng)典的色譜法已不能滿足大量檢測任務(wù)的需要，因此ELISA快速檢測試劑盒由于其方便、快速和靈敏檢測而被廣泛應(yīng)用。國內(nèi)有關(guān)克侖特羅檢測的報道主要集中在生豬尿樣、肝臟、肌肉組織［9-10］，而未見ELISA法檢測牛血液樣品的前處理的報道。在規(guī)?；幕钆Ｍ涝讏?，ELISA方法是較為理想的牛血液克侖特羅殘留篩選性分析方法之一，但是牛血液樣品放置時間過長、血樣品溶血、血樣品被細菌污染、補體、膽紅素等，均可導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，而血清樣品儲存過久可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，因此，牛血液樣品前處理質(zhì)量是保證檢驗結(jié)果可靠性的重要環(huán)節(jié)。本工作采用單因素實驗和正交實驗方法對牛血液樣品的前處理條件進行優(yōu)化，采用ELISA方法進行克侖特羅殘留的篩選，采用LC-MS/MS法對篩選出的牛血液陽性樣品進行確證實驗，為規(guī)模化活牛屠宰廠控制克侖特羅假陽性結(jié)果提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗用牛血液樣品 實驗前即時采取;克侖特羅標準品 純度99%以上，美國Sigma公司;克侖特羅酶聯(lián)免疫檢測試劑盒 杭州迪恩科技有限公司;抗凝劑 0.48g檸檬酸，1.37g檸檬酸鈉，1.48g葡萄糖用60mL純水溶解后，定容至100mL，4℃保存;甲醇、甲酸 色譜純;β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶 美國Sigma公司;乙酸銨、氫氧化鈉、異丙醇、乙酸乙酯和氨水 分析純，北京化學(xué)試劑公司。

FA2004V電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;Thermo微量移液器 賽默飛世爾(上海)儀器有限公司;TDZ5-WS臺式低速自動平衡離心機 長沙湘儀離心機有限公司;Model680酶標儀 美國;KS康氏振蕩器 金壇市富華儀器有限公司;TQU02361 LC-MS/MS液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Thermo公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海榮華生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素實驗

1.2.1.1 血樣離心前放置時間對檢測結(jié)果的影響采集5頭牛靜脈血，每頭牛靜脈血12管，每管5mL，分別記錄采血時間并編號，血液樣品中未添加抗凝劑。取同一樣品的其中6管血樣于室溫分別放置0、30、60、90、120、150min 后，3000r/min 離心 10min 后即刻檢測每份樣品中克侖特羅的殘留量。取另外6管血樣于室溫分別放置 0、30、60、90、120、150min 后，存放于4℃冰箱保存過夜，次日將血樣從冰箱中取出，3000r/min離心10min，待血清樣品恢復(fù)至室溫時開始檢測每份樣品中克侖特羅的殘留量。

1.2.1.2 血樣離心后放置時間對檢測結(jié)果的影響采集5頭牛靜脈血，每頭牛靜脈血3管，每管5mL，分別記錄采血時間并編號，血液樣品中未添加抗凝劑。將血樣于室溫放置30min后，3000r/min離心10min待測。分別測定相應(yīng)血樣離心后放置時間0、30、60、90、120、180min、4℃ 冰箱過夜保存后的每份樣品中克侖特羅的殘留量。

1.2.1.3 血樣中抗凝劑添加比例對檢測結(jié)果的影響采集5頭牛靜脈血，每頭牛靜脈血6管，抗凝劑與血液的比例分別為:不加抗凝劑、1∶9、1∶8、1∶6、1∶4、1∶3，分別記錄采血時間并編號。血樣于室溫(20～25℃)放置 30min后，3000r/min離心 10min。取離心后同一樣品的血清即刻檢測克侖特羅的殘留量，檢測后余下的血清加蓋于4℃冰箱保存過夜，次日將血清從冰箱中取出，待恢復(fù)室溫后分別檢測每份血清樣品中克侖特羅的殘留量。

1.2.2 正交實驗 以血液離心前放置時間、離心后放置時間、抗凝劑添加比例3個因素按L9(34)正交表進行3因素3水平正交實驗。正交實驗因素水平設(shè)計見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal array design

1.2.3 ELISA法檢測

1.2.3.1 ELISA檢測步驟 將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出。置于室溫(20～25℃)平衡60min左右，將酶標物(凍干粉)、樣品稀釋液(5×)、清洗液(10×)配制成工作液，預(yù)先進行編號，標記標準品和樣品的位置，從板上取下所需數(shù)量的微孔，在各標準孔中加入50μL的標準品溶液，在各樣品孔中加入50μL樣品溶液，立即在所有孔中加入100μL的酶標物，輕輕晃動反應(yīng)板幾秒鐘，室溫下(20～25℃)溫浴10min;倒掉微孔中的液體，在所有微孔中加滿清洗液250～300μL，洗板3次，在吸水紙上拍打，徹底清除微孔中的殘留液和氣泡;清洗程序完成后，立即用微量移液器在每個微孔中加入100μL顯色劑，室溫下(20～25℃)顯色10min;每孔中加入100μL終止液，混勻在450nm下檢測吸光度，10min內(nèi)讀取。

1.2.3.2 ELISA結(jié)果計算 分別檢測每個標準品和樣品的平均吸光度，所有標準品和樣品的平均吸光度B除以空白標準品的平均吸光度B0即B/B0，將每個標準品的B/B0值輸入試劑盒自帶的半對數(shù)系統(tǒng)處理軟件中，對應(yīng)于各自的克侖特羅標準品的濃度可以獲得一個標準曲線(B/B0為縱坐標，標準品的質(zhì)量濃度為橫坐標)，將樣品的B/B0值輸入試劑盒自帶的半對數(shù)系統(tǒng)處理軟件中即可得出在標準曲線上對應(yīng)的克侖特羅濃度，乘以對應(yīng)的樣品稀釋倍數(shù)，即為樣品中克侖特羅實際殘留量。

1.2.4 LC-MS/MS液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確證實驗液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法具有干擾小、除去雜質(zhì)能力較高、靈敏度低、可靠性高的優(yōu)點。因此選用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法作為檢測克侖特羅的確證方法［11］。按照正交實驗優(yōu)化的方法處理牛血液樣品，先用 ELISA法進行篩選，然后通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行測定。

1.2.4.1 液相色譜條件 色譜柱:RIDA C18柱(150mm×2.1mm，5μm)，柱溫為 30℃;流動相 A 相為0.1%甲酸甲醇溶液、B相為0.1%甲酸水溶液;流速:0.30mL/min;進樣量:20μL。

1.2.4.2 質(zhì)譜條件 電離方式:ESI+;電離電壓:3.5kV;錐孔電壓:25V;離子源溫度:115℃;錐孔氣流速:50L/h;霧化溫度:320℃;霧化氣流速:750L/h;檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。

1.2.4.3 結(jié)果計算 以克侖特羅標準品的峰面積Y為縱坐標，以克侖特羅標準品質(zhì)量濃度為X軸，分別測定質(zhì)量濃度為 0.0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0μg/L 的克侖特羅標準品溶液的響應(yīng)值，繪制標準曲線，得到標準曲線方程。將樣品的響應(yīng)值代入標準曲線方程中，從標準曲線方程計算出樣品對應(yīng)的克侖特羅質(zhì)量濃度，即為樣品中克侖特羅實際殘留量。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 血樣離心前放置時間對檢測結(jié)果的影響 由圖1可見，當血樣放置30min離心按照ELISA方法進行檢測，血樣中克侖特羅殘留濃度最低，血樣放置60、90、120、150min 離心進行檢測，檢測結(jié)果差異不顯著(p＞0.10)。血液放置未過夜條件下，與60、90、120min離心檢測的結(jié)果相比，放置150min離心檢測結(jié)果呈現(xiàn)下降趨勢。血液樣品放置4℃過夜后再離心，得到的血清樣品透明清澈，檢測結(jié)果差異不顯著(p＞0.10)，與離心前放置30min后檢測的結(jié)果基本保持一致，從圖中的變化趨勢可見血液樣品離心前放置時間對檢測結(jié)果有一定影響。

圖1 血液離心前放置時間對檢測結(jié)果的影響Fig.1 Effect of standing time of blood sample before centrifugation on test results

在規(guī)?；钆Ｍ涝咨a(chǎn)實踐中采集到血液樣品不可能立即進行離心檢測，采集后的血液經(jīng)放置一段時間離心有利于提高血清樣品的質(zhì)量，血液未開始凝固或凝固不完全時就強行離心，此時分離的血清中仍殘留部分纖維蛋白原，進行ELISA檢測時，容易造成假陽性結(jié)果，所以為確保檢測結(jié)果的準確性，血液樣品采集后應(yīng)放置適當?shù)臅r間后再進行離心。如果離心后的血清樣品出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，紅細胞溶解時會釋放出具有類過氧化物酶活性的物質(zhì)，其作用與辣根過氧化物酶類似，如果反應(yīng)孔非特異吸附類過氧化物酶活性的物質(zhì)，則可催化底物顯色加深，容易造成假陽性［12］。溶血現(xiàn)象在超微量、高精度檢測分析中顯然不可忽視，因此，控制樣品離心前放置時間，減少溶血是保證檢驗質(zhì)量的重要因素。龍憲和等［13］研究發(fā)現(xiàn)，無論在健康人還是乙型肝炎病毒感染者中，溶血均導(dǎo)致ELISA一步法檢測HBsA假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。本實驗所采用的檢測試劑盒為一步法檢測，如果處理不當很可能會出現(xiàn)溶血樣品檢測假陽性的結(jié)果。

2.1.2 血樣離心后放置時間對檢測結(jié)果的影響 由圖2可見，隨著血清樣品放置時間的延長，60、90、120min時檢測結(jié)果呈上升趨勢，120min時檢測結(jié)果最高，隨后檢測結(jié)果呈現(xiàn)下降趨勢，血樣離心后即刻檢測、離心后放置60min、離心后放置150min及4℃過夜保存，克侖特羅檢測結(jié)果差異不顯著(p＞0.10)。

圖2 血液離心后放置時間對檢測結(jié)果的影響Fig.2 Effect of standing time of blood sample after centrifugation on test results

2.1.3 血樣中抗凝劑添加比例對檢測結(jié)果的影響由圖3可見，隨著血液樣品中抗凝劑添加比例的增加，檢測結(jié)果呈現(xiàn)下降趨勢。血液離心后直接檢測和離心后放置4℃冰箱過夜保存后檢測，檢測結(jié)果變化不明顯，只是抗凝劑添加比例1∶9時檢測結(jié)果有差異，即4℃冰箱過夜保存比離心后直接檢測結(jié)果偏低。添加抗凝劑離心分離的血清均比未添加抗凝劑分離的血清清澈透明，血液樣品中添加抗凝劑，有利于提高離心后血清質(zhì)量，從而保證檢測結(jié)果的準確。

圖3 血液中抗凝劑添加比例對檢測結(jié)果的影響Fig.3 Effect of proportion of added anticoagulants in blood on test results

2.2 正交實驗

2.2.2 直觀分析和方差分析 從表2、表3的直觀分析可知，各因素的最好水平為A2B1C2;比較各因素的極差可以看出，各因素對克侖特羅殘留檢測結(jié)果的影響，依程度排序為A＞C＞B。A之所以影響最大，很可能是因為血液放置不同時間后離心得到的血清質(zhì)量不同所致。

通過表 4 方差分析可知，F(xiàn)A＞F0.95(2，2)=19.0，F(xiàn)C＞ F0.90(2，2)=9.0，F(xiàn)B＜ F0.90(2，2)=9.0，說明 A、C 兩因素分別在顯著水平0.05、0.10上差異顯著，B因素差異不顯著，與直觀分析的結(jié)果一致。因此提高克侖特羅殘留檢測結(jié)果準確性的最佳血液樣品前處理條件是A2B1C2，即離心前放置30min、離心后放置時間0min、抗凝劑添加比例為 1∶9。

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Orthogonal array design experiment results

表3 正交實驗結(jié)果直觀分析Table 3 Intuitive analysis for Clenbuterol residues with various factors

表4 正交實驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis for Clenbuterol residues with various factors

2.3 確證實驗

采用ELISA法按照優(yōu)化的血液樣品前處理條件對30份牛血液樣品進行檢測，并用LC-MS/MS液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對陽性樣品進行確證實驗。

分別配制質(zhì)量濃度2.0、4.0μg/L的標準品溶液，在全掃描方式下進樣，調(diào)節(jié)電離源各個參數(shù)得到較強的［M+H］峰。在該條件下，對確定的母離子m/z277.100行子離子掃描，優(yōu)化碰撞能量等參數(shù)，確定定量離子m/z 203.001，克侖特羅的離子流色譜圖，見圖4。

2.3.1 ELISA法檢測靈敏度 同時測定50份空白牛血清樣品的吸光度，按照1.2.3.2得出對應(yīng)于吸光度的血清樣品的濃度。檢測限y=ˉx+3s(ˉx為50份空白樣品濃度的平均值，s為50份空白樣品濃度的標準差)，ELISA法檢測牛血清樣品的檢測限為0.081μg/L，ELISA 試劑盒在 0.1～8.1μg/L 范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

2.3.2 LC-MS/MS 標準曲線 取 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0μg/L的克侖特羅標準溶液，經(jīng)LC-MS/MS分析，繪制標準曲線。結(jié)果表明克侖特羅在0.25～4.0μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，當以克侖特羅的峰面積和克侖特羅質(zhì)量濃度進行線性回歸，得到克侖特羅線性方程為y=60923.8x+1800.03，相關(guān)系數(shù)R2=0.9981。

圖4 克侖特羅標準品的色譜圖Fig.4 Chromatogram of 2、4μg/L standard clenbuterol

圖5 克侖特羅標準曲線Fig.5 Standard curves of Clenbuterol

2.3.3 樣品的分析檢測結(jié)果 采用ELISA法按照優(yōu)化的血液樣品前處理條件對30份牛血液樣品中克侖特侖殘留進行檢測，篩選出2份陽性樣品(結(jié)果超過1.0μg/L)，結(jié)合 ELISA 試劑盒在 0.1～8.1μg/L 范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，確定在1.0～8.1μg/L線性范圍內(nèi)，ELISA檢測結(jié)果呈陽性。用LC-MS/MS液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對陽性樣品進行確證實驗，確證實驗結(jié)果表明在1.0～8.1μg/L線性范圍內(nèi)，ELISA法檢測結(jié)果假陽性率為0%。結(jié)果見表5，陽性樣品的LC-MS/MS測定的質(zhì)量色譜圖如圖6所示。

表5 樣品的ELISA法和LC-MS/MS法檢測結(jié)果比較(μg/L)Table 5 Comparison of clenbuterol residues in positive samples determined by ELISA and LC-MS/MS(μg/L)

3 結(jié)論

通過控制血液離心前放置時間、離心后放置時間、抗凝劑添加比例，可以有效提高血清樣品的質(zhì)量，最大程度的減少ELISA法檢測牛血液樣品中克侖特羅殘留量假陽性的結(jié)果。分析前牛血液樣品處理的各因素對克侖特羅殘留檢測結(jié)果的影響程度為:離心前放置時間＞抗凝劑添加比例＞離心后放置時間，牛血液樣品最佳前處理條件為離心前放置30min、抗凝劑添加比例為 1∶9、離心后放置時間0min。

圖6 克侖特羅陽性樣品的色譜圖Fig.6 Chromatogram of positive clenbuterol samples

按照牛血液樣品最佳前處理條件，用ELISA法檢測30份樣品和用LC-MS/MS確證實驗得出:在1.0～8.1μg/L線性范圍內(nèi)，ELISA法檢測結(jié)果假陽性率為0%。

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