綠茶多酚的最適沖泡溶出條件及成分分析

陳正函，呂曉玲，*，徐蕾然，孟 穎，張 鋒

(1.天津科技大學(xué)，天津300457;2.葫蘆島茂華生物有限責(zé)任公司，遼寧葫蘆島125203)

茶起源于中國，是我國的國飲，并且享譽中外。古人有稱之為“南方之嘉木”;《桐君錄》中記載，“西陽、武昌、晉陵皆出好茗”;歐陽修也有“建安三千里，京師三月嘗新茶”的詞句［1］。起初，茶用于藥用、食用，后來開始飲用，并且伴隨茶文化的發(fā)展，形成了一個泡茶與飲茶的藝術(shù)——茶藝。但生活質(zhì)量逐漸提高的同時，忙碌之余，倒一些熱水，喝茶更多的是為了補充水分，增加口感，而像茶藝那樣的品茗就相對少了一些。茶多酚由茶葉中的黃烷醇類(兒茶素類)、花青素類、黃酮、黃酮醇類等30多種多酚類物質(zhì)組成，是對人體有益的活性成分，能夠消除自由基、絡(luò)合金屬離子，具有抗氧化活性，增強機體免疫力［2-5］。目前關(guān)于茶多酚的研究多集中于其性質(zhì)［6］、含量測定［7］及如何提高提取率［8］，而沖泡條件的研究也僅局限于時間、溫度等主要因素，忽略了沖泡容器、習(xí)慣等因素對溶出量的影響。本文從生活角度出發(fā)，系統(tǒng)全面的對泡茶的主要因素、個人生活習(xí)慣因素進(jìn)行研究，使泡茶過程中茶多酚溶出量得到提高。以綠茶為研究對象，采用單因素和響應(yīng)面分析方法，得出合適的沖泡條件，并通過高效液相色譜法［9］進(jìn)一步探討最適條件沖泡中兒茶素類和咖啡堿的溶出量對滋味的影響，為科學(xué)研究及科學(xué)飲茶提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

綠茶(江蘇洞庭碧螺春)購于市場，2011年3月產(chǎn);無水碳酸鈉、沒食子酸 均為分析純;福林酚試劑 天津博美科生物技術(shù)有限公司;表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素(EGC)、沒食子兒茶素(GC)、表兒茶素(EC)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、兒茶素(C)、咖啡堿(caffeine)標(biāo)準(zhǔn)品 上海順勃生物工程有限公司。

UV-2102 PCS型紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;LC-20A型高效液相色譜系統(tǒng)日本島津公司。

1.2 試樣沖泡與茶多酚的測定方法

模擬生活泡茶，以綠茶為樣品，在不同的溫度、液料比、時間、次數(shù)、沖泡容器、是否加蓋和攪拌條件下進(jìn)行實驗，分析不同因素對茶湯中茶多酚溶出量的影響，采用GB/T 8313-2008［10］福林酚法對茶湯中多酚的溶出量進(jìn)行計算。

1.2.1 沖泡溫度對茶多酚溶出量的影響 稱取1.0g的綠茶，分別加入 100mL 60、70、80、90、100℃的蒸餾水，沖泡5min，不攪拌，沖泡一次，過濾，用少許蒸餾水清洗濾渣，合并濾液，定容至100mL，測定茶湯中茶多酚溶出量。

1.2.2 液料比對茶多酚溶出量的影響 稱取1.0g綠茶，分別以液料比為 50∶1、100∶1、150∶1、200∶1、250∶1(mL/g)加入80℃蒸餾水沖泡5min，測定茶多酚溶出量。

1.2.3 沖泡時間對茶多酚溶出量的影響 稱取1.0g綠茶，加入150mL 80℃的蒸餾水分別沖泡2、5、8、11、14min，測定茶多酚溶出量。

1.2.4 沖泡次數(shù)對茶多酚溶出量的影響 稱取1.0g綠茶，加入150mL 80℃的蒸餾水沖泡5min，過濾后的濾渣繼續(xù)進(jìn)行第二次、第三次沖泡，測定茶多酚溶出量。

1.2.5 生活習(xí)慣因素對茶多酚溶出量的影響 稱取1.0g綠茶分別置于同內(nèi)徑的保溫杯和玻璃杯中，加入150mL 80℃的蒸餾水沖泡5min，另采用保溫杯進(jìn)行加蓋與無蓋處理以及在無蓋條件下進(jìn)行攪拌和不攪拌處理的實驗，測定茶多酚溶出量。

1.3 響應(yīng)面分析實驗優(yōu)化茶多酚提取工藝

采用Design Expert 7.0，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取溫度、液料比和時間三個因素，以茶多酚溶出量為響應(yīng)值，采用三因素三水平響應(yīng)面分析方法對茶多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面實驗因素與水平見表1。

表1 實驗因素水平及編碼表Table 1 Codes and levels of factors chosen for test

1.4 兒茶素類及咖啡堿的測定方法

1.4.1 色譜條件 采用Zorbax SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱，流動相A:3%甲酸水溶液，流動相 B:甲醇。梯度洗脫程序為(min/B%):0/2、20/32、30/40。檢測波長 278nm，流速 1.0mL/min，柱溫 35℃，進(jìn)樣量20μL。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別精密稱取8種標(biāo)準(zhǔn)品10mg置于10mL的容量瓶中，定容即得濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，分別吸取一定量的上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液配成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。為方便與樣品圖進(jìn)行分析，配制濃度分別為咖啡堿 100μg/mL、EGCG 50μg/mL、EGC 200μg/mL、ECG100μg/mL、GCG100μg/mL、EC 100μg/mL、C 50μg/mL 和 GC 200μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4.1條件進(jìn)樣得到混合標(biāo)準(zhǔn)品液相圖。

1.4.3 樣品溶液的制備 以響應(yīng)面分析實驗得到的綠茶茶多酚最適沖泡條件進(jìn)行沖泡，茶湯過0.22μm水相濾膜，進(jìn)樣測定峰面積，根據(jù)各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線得出濃度并算出溶出量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉX±SD)表示，每個處理重復(fù)3次，顯著性分析采用SPSS17.0分析軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 溫度對茶多酚溶出量的影響 由圖1可知，60～80℃茶多酚溶出量隨著溫度的升高而增加明顯，隨后增加變緩，80～100℃間差異不顯著(p＞0.05)。因綠茶采用嫩葉加工制成，水溫過低，溶出量較少，水溫過高，湯色易變黃，茶葉表面易熟化、結(jié)膜，阻礙茶多酚等成分的溶出，且維生素C等有益成分易遭破壞，綜合考慮，選取80℃為最適溫度。

圖1 溫度對綠茶茶多酚溶出量的影響Fig.1 Effect of temperature on the polyphenol contents of green tea infusion

2.1.2 液料比對茶多酚溶出量的影響 由圖2可知，50～150mL/g時隨著液料比的增加，茶多酚溶出量增大，150∶1(mL/g)時達(dá) 113.87mg/g，隨后呈輕微下降趨勢，在相同的溫度和時間里，水量越大，降溫速度越慢，茶多酚會部分發(fā)生氧化，并且伴隨茶湯中溶出物含量增多，溶劑比例增加，對溶出物起到一定的稀釋作用，影響口感，故選擇150∶1(mL/g)為最適液料比。

2.1.3 時間對茶多酚溶出量的影響 由圖3可知，綠茶的茶多酚溶出量隨著時間的增加，呈現(xiàn)先增后減的趨勢，且在5min達(dá)到最大值，一般茶的滋味隨著沖泡時間延長而逐漸增濃，茶多酚溶出量逐漸增大，但時間過長，會造成部分茶多酚氧化，選擇5min為最適時間。

2.1.4 次數(shù)對茶多酚溶出量的影響 不同沖泡次數(shù)對茶多酚溶出量的影響見圖4。第一次沖泡可使大部分茶多酚溶出，第二次后溶出量明顯減少，而隨著次數(shù)的增加，較易溶出的氨基酸、維生素C和可溶性糖等成分的溶出量減少，口感明顯變差，因此確定沖泡次數(shù)為1次。

表2 生活習(xí)慣因素對茶多酚溶出量的影響Table 2 Effect of habit factors on the polyphenol contents in tea infusions

圖2 液料比對綠茶茶多酚溶出量的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratioon the polyphenol contents of green tea infusion

圖3 時間對綠茶茶多酚溶出量的影響Fig.3 Effect of time on the polyphenol contents of green tea infusion

圖4 次數(shù)對綠茶茶多酚溶出量的影響Fig.4 Effect of brewing times on the polyphenol contents of green tea infusion

2.1.5 生活習(xí)慣因素對茶多酚溶出量的影響 采用綠茶對生活習(xí)慣因素(沖泡容器、是否加蓋、是否攪拌)沖泡下茶多酚的溶出量進(jìn)行研究，其中沖泡容器選擇玻璃杯和保溫杯，結(jié)果見表2。保溫杯起到恒溫作用，多酚較易溶出，可見泡茶所用器具對茶多酚的溶出量存在一定的影響，但是作用不大，影響不顯著(p＞0.05)。攪拌可使茶葉充分浸泡，多酚的溶出量大幅度提高，但伴隨著其他成分的大幅度溶出，會一定程度的影響口感，可根據(jù)個人喜好決定攪拌時間。對于綠茶，不加蓋溶出量略高，可根據(jù)實際情況而定。

2.2 響應(yīng)面實驗設(shè)計

2.2.1 響應(yīng)面實驗結(jié)果及方差分析 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)響應(yīng)面實驗設(shè)計，以溫度、液料比、時間3個因素為自變量，茶多酚溶出量為響應(yīng)值，實驗結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面分析實驗結(jié)果Table 3 Results of response surface analysis experiment

經(jīng)二次多項回歸擬合，得到各實驗因子對響應(yīng)面影響的回歸方程為:茶多酚溶出量(mg/g)=116.35+8.05A+1.26B+12.72C-2.72AB-3.55AC-0.33BC-19.60A2-8.58B2-9.02C2。

對模型方程進(jìn)行方差分析表明，該方程顯著，結(jié)果見表4。其中校正決定系數(shù)=0.9622，相關(guān)系數(shù)R2=0.9834，說明回歸方程對實驗擬合度較好，失擬項不顯著，各因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，使響應(yīng)值變化復(fù)雜，所以二次相應(yīng)曲面回歸方程能夠很好的擬合本實驗所得的結(jié)果。

2.2.2 響應(yīng)面曲面分析 響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各因素(A、B、C)所構(gòu)成三維空間的曲面圖，根據(jù)回歸方程作出不同因子的響應(yīng)面分析圖，結(jié)果見圖5。響應(yīng)面圖代表著在第三個變量保持最佳水平時，另兩個獨立變量之間的交互作用。

由響應(yīng)面實驗得綠茶茶多酚最適沖泡條件為:溫度 81.42℃、液料比 151.92∶1(mL/g)、時間7.03min，茶多酚溶出量理論最大值為121.23mg/g，為了實際操作方便，修正條件為溫度81℃、液料比150∶1(mL/g)、時間7min，采用修改后最適條件進(jìn)行驗證實驗，結(jié)果為茶多酚溶出量為(112.80±0.10)mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.88%。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance for second-order polynomial model fitted to the response variable

圖5 響應(yīng)面分析圖Fig.5 Response surface graphs

2.3 高效液相色譜分析結(jié)果

在以茶多酚為響應(yīng)值得出的最適條件下進(jìn)行沖泡，采用高效液相色譜法，以總酚研究為基礎(chǔ)，對茶湯中兒茶素類及咖啡堿溶出量進(jìn)行分析，進(jìn)一步探討最適沖泡條件下各成分溶出量之間相互作用對茶滋味的影響。各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍見表5，其中保留時間與混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖相對應(yīng)?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品色譜圖(A)及綠茶最適沖泡條件下樣品色譜圖(B)見圖6。由圖6可知，樣品與標(biāo)準(zhǔn)品圖中所對應(yīng)峰的信息一致，雖綠茶成分復(fù)雜，但所研究成分在30min內(nèi)均得到分離，可以進(jìn)行HPLC定量分析。

圖6 混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖和樣品色譜圖Fig.6 Chromatograms of standard solution and sample solution

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程與峰面積可計算出各成分的溶出量，結(jié)果見表6。在響應(yīng)面最適條件下沖泡，總兒茶素溶出量占茶多酚溶出量的57.29%，是多酚類物質(zhì)的主體部分，賦予了綠茶特有的澀味。其中EGCG、ECG、EGC和EC的溶出量較高，GCG未檢出，C和GC的溶出量較少。除總酚外，咖啡堿溶出量也較高，使綠茶略帶苦味，因綠茶屬不發(fā)酵茶，咖啡堿的含量相比較其他發(fā)酵茶略低些，但最適條件沖泡仍得到較高的溶出量，與兒茶素類共同作用，對改善茶湯的滋味起到一定的作用，減輕單一存在的苦味和澀味，使茶味醇和。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程Table 5 Linear equation of the standard

表6 綠茶茶湯兒茶素類和咖啡堿Table 6 Catechins and caffeine of green tea infusion

3 結(jié)論

本實驗?zāi)M生活泡茶，以綠茶為樣品，研究了溫度、液料比、時間、次數(shù)以及生活習(xí)慣因素對茶多酚溶出量的影響。通過單因素實驗和響應(yīng)面分析實驗得出綠茶茶多酚的最適沖泡溶出條件:1g綠茶加150mL水在 81℃下沖泡 7min，茶多酚溶出量為112.80mg/g。生活中小小的變化可以使溶出量大幅度提高，為避免口感過于單薄或濃重，在可接受范圍內(nèi)可適當(dāng)攪拌，不同的容器和是否加蓋可根據(jù)個人生活習(xí)慣以及口感需求進(jìn)行調(diào)整。在最適條件下沖泡，采用液相對兒茶素類和咖啡堿進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)EGCG、ECG、EGC、EC 和咖啡堿有較高的溶出量，對改善綠茶的滋味起著重要的作用。

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