花生紅衣粗多酚體外抗氧化活性研究

劉 曼，韓升廷，張海悅，魏 瀅

（長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130012）

我國(guó)是產(chǎn)花生大國(guó)，年產(chǎn)量超過(guò)五百萬(wàn)噸，且種類(lèi)繁多?！八牧＜t”花生是吉林省特有的農(nóng)產(chǎn)品之一，品質(zhì)很高，并且四粒紅花生中的多酚類(lèi)物質(zhì)含量十分豐富，是花生中的精品。國(guó)內(nèi)花生制品廠對(duì)花生紅衣并沒(méi)有進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用，每年能產(chǎn)生約600t花生紅衣廢料，除少量用于制藥外，其余都用作飼料造成極大浪費(fèi)。多酚類(lèi)化合物具有多種生物活性，對(duì)于人類(lèi)的健康具有積極作用，其中最重要的是它的抗氧化和清除自由基的活性[1-4]。本實(shí)驗(yàn)研究了花生紅衣的體外抗氧化活性，為其應(yīng)用到功能食品中奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

四粒紅花生紅衣 四平宏寶萊股份有限公司，為生產(chǎn)花生露的廢棄料，粉碎20目烘干備用；無(wú)水乙醇、丙酮、七水硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、過(guò)氧化氫（30%）、抗壞血酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鄰苯三酚、水楊酸、鹽酸等 均為國(guó)產(chǎn)分析純；沒(méi)食子酸丙酯標(biāo)準(zhǔn)品純度≥99% 北京北研馨綠生物技術(shù)有限公司；總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；實(shí)驗(yàn)用水二次蒸餾水。

RE52-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；FWl00高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；JY3002電子天平 北京賽多利斯儀器有限公司；PC-1000數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋 上海躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠；DHG-9070A鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；GL-21LM高速冷凍離心機(jī) 湖南星科科學(xué)儀器有限公司；Lambda 25紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)日本島津。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗多酚提取液的制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取花生紅衣粉末3份各20g放入3個(gè)錐形瓶中，分別用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇、60%丙酮、蒸餾水為溶劑提取花生紅衣粗多酚。提取條件為：60℃恒溫水浴，提取時(shí)間2h，料液比1∶15g/mL，提取結(jié)束后抽濾，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓濃縮至100mL，得到花生紅衣的乙醇、丙酮、蒸餾水粗多酚供試液，放入冰箱中備用。

參照多酚類(lèi)物質(zhì)定性鑒定方法[5]：用體積分?jǐn)?shù)2%的三氯化鐵-乙醇溶液對(duì)提取液進(jìn)行顯色反應(yīng)，溶液呈現(xiàn)墨綠色，同時(shí)提取液與溴水反應(yīng)，出現(xiàn)白色沉淀；以上現(xiàn)象說(shuō)明提取液有中多酚類(lèi)物質(zhì)存在。

1.2.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定 準(zhǔn)確稱(chēng)取5mg沒(méi)食子酸丙酯標(biāo)品，用無(wú)水乙醇定容至50mL。以無(wú)水乙醇做空白，進(jìn)行200～800nm的全波長(zhǎng)掃描。

1.2.3 總多酚含量測(cè)定 配制酒石酸鐵溶液和pH為7.5的緩沖液[6-8]。

分別吸取0、1、2、3、4、5mL沒(méi)食子酸丙酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液于50mL容量瓶中，加8mL蒸餾水，再加10mL酒石酸鐵溶液，用緩沖液定容。用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值。以蒸餾水代替沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制空白，繪制總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

精密吸取各多酚提液1mL于棕色容量瓶中，按上述標(biāo)準(zhǔn)溶液制作方法測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度值，求得試樣中總多酚的含量，平行測(cè)5次取平均值，計(jì)算公式如下：

其中，y為提取液吸光度；m為花生紅衣質(zhì)量；a為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)截距。

1.2.4 多酚粗提液總抗氧化能力（T-AOC）的測(cè)定采用T-AOC測(cè)定試劑盒對(duì)花生紅衣中提取出來(lái)的總酚進(jìn)行抗氧化能力測(cè)試。

測(cè)定原理：機(jī)體中有許多抗氧化物質(zhì)，能使Fe3+還原成Fe2+，后者可與菲啉類(lèi)物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物，通過(guò)比色可測(cè)出其抗氧化能力的高低。

測(cè)定方法：精密吸取各多酚提取液0.1mL，分別按照表1和表2配制測(cè)定管和對(duì)照管。并用體積分?jǐn)?shù)為0.02%的VC做陽(yáng)性對(duì)照。

表2 抗氧化實(shí)驗(yàn)操作步驟表Table 2 The antioxidant experiment operation step table

配制結(jié)束后混勻試劑，放置10min，以蒸餾水為空白，在520nm測(cè)定吸光度值?？偪寡趸芰τ?jì)算公式：

式中，ODU為測(cè)定管吸光度值；ODC為對(duì)照管吸光度值；N為反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)（反應(yīng)液總體積/取樣量）；n為樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

在37℃時(shí)，每分鐘每毫升提取液使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01時(shí)，為一個(gè)總抗氧化能力單位。1.2.5 多酚粗提液對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力的測(cè)定 采用鄰苯三酚自氧化法。

鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定[9-11]：取4.5mL 50mmol/L的Tris-鹽酸緩沖溶液（pH8.2）與4.2mL蒸餾水混勻后在25℃水浴中保溫20min，取出后立即加入在25℃預(yù)熱過(guò)的3mmol/L鄰苯三酚溶液0.3mL，迅速搖勻后倒入比色皿中，在320nm下每隔30s測(cè)定吸光度，計(jì)算線(xiàn)性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加，以10mmol/L鹽酸溶液配制空白樣作為對(duì)照。

加入多酚提取液后鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定：按照上述步驟在加入鄰苯三酚前先加入0.1mL多酚提取液，同樣以10mmol/L鹽酸溶液配制空白樣作為對(duì)照，測(cè)定吸光度。并用體積分?jǐn)?shù)0.02%的VC做陽(yáng)性對(duì)照。抑制率按下公式計(jì)算。

抑制率（%）＝（ΔA1/Δt- ΔA2/Δt）/ΔA1/Δt×100

式中：ΔA1/Δt-鄰苯三酚自氧化時(shí)反應(yīng)速率；ΔA2/Δt-加入樣品液后鄰苯三酚自氧化時(shí)反應(yīng)速率。1.2.6 多酚粗提液對(duì)羥基自由基（·OH）清除作用的測(cè)定 利用過(guò)氧化氫和鐵離子混合產(chǎn)生羥自由基，在體系內(nèi)加入水楊酸產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510nm波長(zhǎng)處有最大吸收波長(zhǎng)。反應(yīng)體系中含8.8mmol/L H2O21mL、9mmol/L FeSO41mL、9mmol/L水楊酸-乙醇溶液1mL、花生紅衣粗多酚提取液0.3mL。在37℃反應(yīng)0.5h，以蒸餾水為空白，在510nm處測(cè)量花生紅衣粗多酚提取液的吸光度?？紤]到花生紅衣粗多酚提取液的吸光度，以9mmol/L FeSO41mL、9mmol/L水楊酸-乙醇溶液1mL、花生紅衣粗多酚提取液0.3mL和1mL蒸餾水在510nm波長(zhǎng)處的吸光度作為花生紅衣粗多酚的本底吸光度[12-15]。并用體積分?jǐn)?shù)為0.02%的VC做陽(yáng)性對(duì)照。清除率計(jì)算公式如下：

式中，A0為空白對(duì)照液的吸光度；A1為加入花生紅衣粗多酚提取液的吸光度；A1x為不加顯色劑H2O2花生紅衣粗多酚提取液本底的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

由圖1看出，沒(méi)食子酸丙酯在540nm附近有最大吸收峰，因此最大吸收波長(zhǎng)為540nm。

2.2 花生紅衣提取液粗多酚含量測(cè)定

按照1.2.3的方法制作總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為：y=49.586x+0.0039，R2=0.9996。對(duì)花生紅衣多酚提取液樣品中總多酚的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1 沒(méi)食子酸丙酯標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品紫外光譜Fig.1 Gallic acid propyl standard reference substance ultraviolet spectrum

表3 提取液中總多酚含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Extract of total polyphenol content determination results

由表3可看出，提取劑對(duì)提取物中總多酚的含量高低有一定的影響，3種花生紅衣粗多酚提取液中，60%乙醇酚提液總酚含量最高，60%丙酮酚提液次之，蒸餾水酚提液含量較低。因此在今后的研究中選擇60%乙醇為最佳提取溶劑。

2.3 多酚粗提液T-AOC

按照1.2.4的方法對(duì)三種提取液抗氧化能力進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如表4所示。

表4 不同提取液的T-AOC結(jié)果Table 4 Effect of different extracts of T-AOC results

由表4可以看出，三種花生紅衣粗多酚提取液均有總抗氧化能力，其中60%乙醇提取液總抗氧化能力最高，60%丙酮提取液次之，蒸餾水提取液總坑氧化能力最弱。與0.02%的VC對(duì)比，60%乙醇提取液總抗氧化能力高于0.02%的VC，60%丙酮提取液的總抗氧化能力與VC相當(dāng)，蒸餾水提取液總抗氧化能力低于0.02%的VC。

2.4 多酚粗提液對(duì)O2-·的清除能力

按照1.2.5的方法對(duì)三種提取液對(duì)O2-·的清除能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表5所示。

表5 不同提取液對(duì)O2-·抑制率Table 5 Effect of different extracts on O2-·inhibition rate determination results

由表5可以看出三種花生紅衣粗多酚提取液中，60%乙醇提取液對(duì)O2-·抑制率最高，60%丙酮提取液與蒸餾水提取液對(duì)O2-·抑制率相當(dāng)。與0.02%VC相比，60%乙醇提取液對(duì)O2-·抑制率高于0.02%VC，60%丙酮提取液和蒸餾水提取液對(duì)O2-·抑制率均低于0.02%的VC。

2.5 多酚粗提液對(duì)·OH清除作用的測(cè)定

按照1.2.6的方法對(duì)三種提取液的·OH的清除作用進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表6所示。

表6 不同提取液對(duì)羥自由基（·OH）清除率結(jié)果Table 6 Effect of different extraction on hydroxyl free radical（·OH）clearance rate results

由表6可以看出，三種花生紅衣多酚粗提液中，60%乙醇提取液對(duì)·OH清除率最高，60%丙酮提取液次之，蒸餾水提取液對(duì)·OH清除率最弱。與0.02%VC對(duì)比，60%乙醇提取液對(duì)·OH清除率與0.02%的VC相當(dāng)，60%丙酮提取液略低于0.02%的VC，蒸餾水提取液對(duì)·OH清除率低于0.02%的VC。

3 結(jié)論

體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)證明，3種花生紅衣粗多酚提取液均具有一定的抗氧化活性，并且60%乙醇提取液抗氧化能力高于0.02%VC。在3個(gè)不同的抗氧化體系中，60%乙醇提取液的抗氧化活性始終最強(qiáng)，60%丙酮提取液的抗氧化活性次之，而蒸餾水提取液的抗氧化活性相對(duì)稍差；這與3種酚提液中總多酚含量的高低排序相一致，表明多酚類(lèi)物質(zhì)在花生紅衣提取液的抗氧化活性中有重要作用，使用乙醇作為溶劑可以得到較多的多酚類(lèi)活性物質(zhì)。

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