夏枯草中多糖的提取與含量的測定

張霞，聶少平，李景恩，李卷梅，林慧霞，李昌，謝明勇

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330047）

夏枯草（Prunella vugarisL.）為唇形科（Labiatae）夏枯草屬（prunella）植物，多年生草本，全球約15種，廣泛分布于歐亞溫帶地區(qū)及熱帶山區(qū)，非洲北部及北美洲也有分布，我國產(chǎn)4種3變種，其中1種為引種栽培，主要產(chǎn)于湖南、安徽、浙江、江蘇等地[1-2]。它具有幾千年的藥用歷史，其果穗和全草均可入藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載其“主寒熱、瘰疬、鼠瘺、頭瘡，破癥，散癭結(jié)氣，腳腫濕痹”，具有清火、明目、清肝、散結(jié)及消腫之功效。

近年來國內(nèi)外學(xué)者對(duì)夏枯草進(jìn)行了廣泛的研究，尤其在其化學(xué)成分和藥理研究方面作了較深入的探討[3-7]，研究表明，夏枯草含有多種活性化學(xué)成分，具有抗菌、降壓、抗炎、抗腫瘤、降血糖等作用[8-12]，其中多糖作為夏枯草的重要活性成分也受到廣泛關(guān)注，為了進(jìn)一步研究夏枯草多糖的理化性質(zhì)及活性，為其后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)經(jīng)過前處理去雜質(zhì)后的夏枯草樣品進(jìn)行熱水浸提，得樣品溶液，采用苯酚-硫酸比色法[13-15]測定其多糖含量，實(shí)驗(yàn)中為減少誤差采用精制夏枯草多糖測得夏枯草多糖對(duì)葡萄糖的換算因子。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

夏枯草，粉碎，貯于干燥器中備用。無水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、正丁醇、濃硫酸、苯酚、葡萄糖等試劑除注明外均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1104電子天平：上海精天電子儀器廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；SHZ-IIIB循環(huán)水真空泵：上海亞榮生化有限公司；TGL-5-A離心沉淀機(jī)：上海安亭分析儀器有限責(zé)任公司；EYELAN-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：廈門精藝興業(yè)科技有限公司；DZG-6050型真空干燥箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DGG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；CQ超聲微清洗器：上海超聲波儀器廠；透析袋（規(guī)格為 8 000～10 000 Da）：Sigma公司；TU-1900雙光束紫可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 夏枯草多糖的提取與精制

稱取經(jīng)干燥粉碎后過20目篩的夏枯草粉末200g，用1 600 mL 80%乙醇浸泡24 h。用雙層濾布過濾，濾渣陰干后，按料水比1∶20 g/mL在90℃熱水中浸提2 h，間歇攪拌，雙層濾布過濾，濾渣重復(fù)提取兩次，合并三次濾液，在4 800 r/min條件下離心分離10 min，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行真空濃縮（55℃、50 r/min、真空度0.095 MPa），使?jié)饪s液約為原體積的1/5，然后向濃縮液中加入無水乙醇使乙醇濃度達(dá)70%，于4℃冰箱中醇沉 24 h，再離心分離（4 800 r/min，10 min），棄去上清液，將所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚各洗滌兩次，在55℃條件下真空干燥，得夏枯草粗多糖。將干燥的粗多糖用蒸餾水溶解，采用Sevag法脫蛋白，加入約為樣液體積1/3量的氯仿、正丁醇混合液（氯仿∶正丁醇為4∶1）劇烈振搖10 min，離心分離（4 800 r/min，10 min），分去水層和有機(jī)溶液層交界處的變性蛋白質(zhì)。對(duì)得到的上清液反復(fù)脫蛋白至幾乎無蛋白層，然后將所得溶液先用自來水透析48 h，再用蒸餾水透析24 h，透析完成后，將透析液進(jìn)行真空濃縮（55℃，50 r/min，真空度0.095 MPa），向濃縮液中加入無水乙醇使乙醇濃度達(dá)70%，于4℃冰箱中過夜醇沉，再離心分離（4 800 r/min，10 min），所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚各洗滌兩次，得精制夏枯草多糖，在55℃下真空干燥，所得樣品置干燥器中備用。

1.3.2 測定波長的確定

配制一定濃度的精制夏枯草多糖溶液和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密量取2 mL于具塞試管中，按照1.3.3中所述方法顯色，以等量的蒸餾水作空白，在TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì)上從400 nm～700 nm進(jìn)行掃描，確定精制夏枯草多糖和葡萄糖的最大吸收波長。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.250 2 g，置于250 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，然后再取出10mL置于100mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度、搖勻,配成100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

5%苯酚溶液的配制：稱取苯酚100 g，加鋁片0.1 g和碳酸氫鈉0.05 g，常壓蒸餾、收集（180±2）℃餾分。精密稱取該餾分約5 g置于100 mL容量瓶中，加水溶解至刻度，搖勻后轉(zhuǎn)置于棕色試劑瓶中，即得5%苯酚溶液，置于冰箱中備用（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

分別移取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞試管中，加蒸餾水補(bǔ)至2 mL，配置成系列梯度的葡萄糖溶液，以2 mL蒸餾水作空白，每管加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，沿管壁緩慢加入濃硫酸各5 mL，迅速搖勻，在室溫下顯色35 min后，于490 nm波長處測定吸光度，以吸光度對(duì)葡萄糖濃度作回歸方程。

1.3.4 換算因子的測定[16]

精密稱取干燥至恒重的精制夏枯草多糖100.8 mg，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻配成精制多糖貯備液；再吸取2 mL上述儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得精制夏枯草多糖供試液。采用苯酚-硫酸比色法測定其吸光度，由回歸方程求出此精制夏枯草多糖供試液中葡萄糖濃度，測得其葡萄糖含量，按（1）式計(jì)算換算因子。因夏枯草多糖干燥后溶解性較差，為減少測定誤差，故將按1.3.1中的方法制得多糖透析液真空濃縮后取等量20 mL濃縮液兩份，經(jīng)醇沉洗滌后，一份直接加蒸餾水溶解、定容、比色、測定多糖含量；另一份真空干燥至恒重，稱得精制夏枯草多糖的干重，由二者計(jì)算平均換算因子。

式中：W為稱取多糖的重量，mg；C為精制夏枯草多糖貯備液中葡萄糖濃度，（mg/mL）；D為多糖的稀釋因素，mL。

1.3.5 樣品中夏枯草多糖含量測定

稱取3份約5g干燥過的夏枯草粉末樣品，按1.3.1中多糖的提取方法反復(fù)提取，并分別將提取液加蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，準(zhǔn)確吸取2 mL，按照1.3.3中的方法測定吸光度，吸光度連續(xù)三次變化不大時(shí)，說明樣品中多糖不再溶出，停止提取。合并濾液，在4 800 r/min的條件下離心分離10 min，將上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行真空濃縮（55℃、50 r/min、真空度0.095 MPa），將濃縮液轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，搖勻備用；再準(zhǔn)確移取上述溶液5 mL置于100 mL容量瓶中，定容至刻度搖勻制成待測溶液備用。

精密吸取上述待測液各2 mL于各具塞試管中，按照1.3.3中的方法測定吸光度，由回歸方程計(jì)算樣液中葡萄糖濃度，按（2）式計(jì)算樣品中夏枯草多糖含量。

多糖含量/%=CDf/W×100 （2）

式中：C為供試液中葡萄糖濃度，（mg/mL）；D為多糖的稀釋因素，mL；f為換算因子；W為供試夏枯草樣品的重量，mg。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

配置某一濃度的多糖溶液，確保其吸光度在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，精密吸取該多糖溶液2 mL于具塞試管中，按照1.3.3下的方法測定吸光度，每隔0.5小時(shí)測定1次，連續(xù)2 h考察其穩(wěn)定性。

1.3.7 精密度試驗(yàn)

在照1.3.3的方法測定樣品中多糖含量時(shí)，將其中某一供試樣品溶液連續(xù)測定6次吸光度，考察試驗(yàn)的精密度。

1.3.8 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密稱取5份同一批夏枯草粉末各5 g，按照1.3.5中方法同時(shí)制取5份樣品溶液。精密移取此樣品溶液各2 mL，分別置于具塞試管中，按照1.3.3下的方法測定吸光度，由回歸方程計(jì)算樣液中葡萄糖濃度，按（1）式和（2）式計(jì)算夏枯草多糖含量，考察試驗(yàn)的重現(xiàn)性。

1.3.9 加標(biāo)回收率測定

精密稱取5份夏枯草粉末各1 g，按照1.3.5中方法反復(fù)提取濃縮得到浸提液，稱取5份精制夏枯草多糖各約50 mg，用蒸餾水溶解后分別加入前面所得的5份浸提液中，再以蒸餾水定容于250 mL容量瓶中，搖勻，備用。然后分別精密移取10 mL于100 mL容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，搖勻，備用。按照1.3.3的方法測定吸光度，以其平均值作為回收率的計(jì)算結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 最大吸收波長

TU－1900雙光束紫外可見分光光度計(jì)掃描結(jié)果顯示夏枯草樣品溶液在481 nm處有最大吸收，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在490 nm處有最大吸收。因?yàn)槭且云咸烟呛繛闃?biāo)準(zhǔn)測定夏枯草中的多糖含量，所以選擇490 nm作為測定波長，結(jié)果如圖2。

2.2 換算因子

將真空干燥的精制多糖溶解于水，測得換算因子f為2.122。利用等體積的多糖透析液，醇沉洗滌后，一份直接加蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻。再吸取10 mL用蒸餾水定容于100 mL容量瓶中，搖勻后取2 mL于具塞試管中，測其吸光度為0.153。另一份真空干燥至恒重，稱其重量為0.0652g。用這種方法測得換算因子f為2.010，取平均值f為2.066。

2.3 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of glucose solution

回歸方程為y=0.084 8x，R2=0.999 7。由圖1可見，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在10 μg/mL～60 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

夏枯草樣品和葡萄糖光譜掃描圖，見圖2。

圖2 夏枯草樣品和葡萄糖光譜掃描圖Fig.2 UV spectra of sample and glucose

為檢驗(yàn)測定方法的正確性、精確度和穩(wěn)定性，本試驗(yàn)進(jìn)行了穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性和加樣回收率實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果分別列于表1～表4。

從表1～表4可以看出，供試液在2 h內(nèi)顯色穩(wěn)定，精密度（RSD=0.312%），測定結(jié)果重現(xiàn)性好（RSD=1.84%），回收率高（平均回收率為101.9%，RSD=2.01%）。

表1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of stability experiments

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 2 Results of precision experiments（n=6）

表3 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 3 Results of reproducibility experiments（n=5）

表4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 4 Results of recovery experiments（n=5）

2.4 夏枯草中多糖含量的測定

實(shí)際樣品含量測定結(jié)果見表5，夏枯草中多糖平均含量為9.3%。

表5 夏枯草中多糖含量測定結(jié)果（n=3）Table 5 Determination results of polysaccharides in Prunella Vulgaris Linn（n=3）

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用苯酚-硫酸法測定夏枯草多糖中的糖含量，該方法的依據(jù)是多糖在濃硫酸作用下水解生成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚濃縮合成橙黃色化合物，反應(yīng)過程中顏色穩(wěn)定，在波長490 nm處和一定濃度范圍內(nèi)，其吸光度與樣品中多糖含量成正比，符合朗伯-比爾定律，從而可以采用分光光度計(jì)測定其吸光度，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測定樣品中的多糖含量。并且本實(shí)驗(yàn)還通過精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和加樣回收率等試驗(yàn)來驗(yàn)證了苯酚-硫酸比色法測定夏枯草中多糖糖含量的準(zhǔn)確可靠性及簡便快捷性，確定了一種簡便可行的測定夏枯草多糖含量的方法。

實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)夏枯草多糖水提液應(yīng)盡可能當(dāng)天浸提當(dāng)天測定，因?yàn)樗嵋悍胖脮r(shí)間過長會(huì)被外界環(huán)境中微生物分解，從而含量降低，影響測定結(jié)果。此外因?yàn)橹参锒嗵堑膯翁墙M成比較復(fù)雜，不同單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率不同，所以用葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線會(huì)引起系統(tǒng)誤差，故實(shí)驗(yàn)過程中采用精制夏枯草多糖計(jì)算換算因子，以避免這種系統(tǒng)誤差，所測結(jié)果明顯高于不使用校正因子所得的結(jié)果。

夏枯草分布廣泛，資源豐富，化學(xué)成分復(fù)雜，藥理作用廣泛，有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)利用價(jià)值，是一種有潛力的藥物資源。夏枯草多糖具有良好的抗氧化性能，根據(jù)自由基理論，應(yīng)具有開發(fā)為功能性食品的潛在價(jià)值[17]。相信隨著研究的不斷深入，夏枯草將在藥理學(xué)、飲品及保健品行業(yè)發(fā)揮越來越重要的作用。

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