乳鐵蛋白對環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫失衡的保護作用

李朝霞，張秋霞，趙暉，汪平

（1.首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京 100069；2.北京東明共成醫(yī)藥科技有限公司，北京 100069）

乳鐵蛋白對環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫失衡的保護作用

李朝霞1，張秋霞1，趙暉1，汪平2

（1.首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京 100069；2.北京東明共成醫(yī)藥科技有限公司，北京 100069）

摘 要：探討乳鐵蛋白對環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫失衡的保護作用。Balb/c小鼠隨機分為6組，正常對照組，模型對照組，乳鐵蛋白組（5、25、50、500 mg/kg）。連續(xù)灌胃給藥27 d，第27天給藥后除正常對照組外，其他小鼠均腹腔注射環(huán)磷酰胺80 mg/kg，繼續(xù)灌胃至第30天，末次給藥24 h后，放射免疫分析方法測定各組小鼠外周血CD4+T、CD8+T細胞。酶聯(lián)免疫分析方法檢測血清細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4，IL-10的變化。與正常對照組相比，模型小鼠外周血CD4+T、CD8+T百分率明顯增加；血清 IFN-γ明顯降低（p<0.01），IL-4明顯增高（p<0.05），IFN-γ/IL-4比值明顯下降（p<0.01）；乳鐵蛋白25、50、500 mg小鼠外周血CD4+T、CD8+T細胞百分率明顯降低（P<0.01或P<0.05）。乳鐵蛋白500 mg組小鼠血清IFN-γ較模型組明顯增高（p<0.05），乳鐵蛋白50、500 mg小鼠血清IFN-γ/IL-4比值趨于正常。乳鐵蛋白能不同程度修復環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫失衡狀態(tài)，具有免疫保護作用。

關鍵詞：乳鐵蛋白；環(huán)磷酰胺；免疫功能

乳鐵蛋白是由中性粒細胞分泌，為非血紅素鐵結合性糖蛋白，屬于轉鐵蛋白家族。對于其功能研究最早開始于其結合鐵的特性的研究。近年研究表明，乳鐵蛋白具有免疫調節(jié)、增強鐵的傳遞和吸收、促進腸道菌群的平衡、廣譜的抗菌、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌等多種生物功能活性[1-2]。

本實驗旨在研究乳鐵蛋白對環(huán)磷酰胺所致免疫損傷小鼠的T細胞亞群及Th1和Th2型細胞因子（IL-2、IFN-γ、IL-4，IL-10）的影響，為乳鐵蛋白的免疫活性研究提供一定的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級Balb/c小鼠，雌雄兼用，6周～8周齡，體質量18 g～22 g，由北京維通利華試驗動物技術有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2006-0009。

1.1.2 藥物及試劑

乳鐵蛋白由日本NRL制藥股份有限公司提供；環(huán)磷酰胺為山東普德藥業(yè)股份有限公司產品；小鼠CD4+T、CD8+T放免檢測試劑盒由北京華英生物技術研究所提供；小鼠細胞因子 IL-2、IFN-γ、IL-4，IL-10檢測試劑盒由上海森雄科技實業(yè)有限公司提供。

1.1.3 主要儀器

r-911全自動放免計數儀：中國科技大學實業(yè)總公司生產；Biofuge15R低溫離心機：Heraeussepatech（德國）；JA-1003電子分析天平：上海精科天平廠；Multiskan MK3型酶標儀：ThermoLabsystem公司（芬蘭）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理

67只小鼠隨機分為6組：正常對照1組10只、正常對照2組10只、乳鐵蛋白5 mg/kg11只、25 mg/kg 11只、50 mg/kg13只、500 mg/kg12只。各給藥組按不同劑量給乳鐵蛋白，灌胃容積為0.2mL/10 g小鼠。正常對照1組與正常對照2組灌胃給等容量的生理鹽水，每天給藥1次。連續(xù)給藥27 d，第27天給藥后除正常對照1組外，其他5組小鼠均腹腔注射環(huán)磷酰胺80 mg/kg，環(huán)磷酰胺注射后繼續(xù)灌胃至第30天，末次給藥后次日，取材，檢測。

1.2.2 指標檢測

末次給藥后，動物禁食12 h，麻醉取血，分離血清，放射免疫分析方法測定各組大鼠外周血CD4+T、CD8+T細胞。酶聯(lián)免疫分析方法檢測血清細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4，IL-10 的變化。

1.2.3 統(tǒng)計方法

運用SPSS 13.0 for windows進行數據統(tǒng)計分析，計量資料采用描述，行單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法進行。

2 結果

2.1 乳鐵蛋白對環(huán)磷酰胺處理小鼠外周血CD4+T、CD8+T細胞的影響

乳鐵蛋白對環(huán)磷酰胺處理小鼠外周血CD4+T、CD8+T細胞的影響，結果見表1。

表1 各組小鼠外周血CD4+T、CD8+T細胞的比較（±s）Table 1 Comparison of CD4+T，CD8+T Cells in Peripheral Blood of Mice（±s）

表1 各組小鼠外周血CD4+T、CD8+T細胞的比較（±s）Table 1 Comparison of CD4+T，CD8+T Cells in Peripheral Blood of Mice（±s）

注：與模型組對比**P<0. 01；*P<0.05。

分組 只數濃度/（mg/kg） CD4+T/% CD8+T/% CD4+/CD8+/%空白對照組 9 36.04±3.53**29.69±2.26** 1.21±0.06模型組 10 46.76±4.34 39.27±5.62 1.20±0.10乳鐵蛋白 11 5 46.55±4.26 39.81±3.37 1.17±0.04乳鐵蛋白 12 25 37.24±5.68**31.91±5.26** 1.17±0.04乳鐵蛋白 11 50 40.12±4.73**33.34±3.47** 1.20±0.07乳鐵蛋白 13 500 42.38±4.56* 34.81±5.80* 1.23±0.13

從表1可以看出，與正常對照組比較，環(huán)磷酰胺處理小鼠外周血CD4+T、CD8+T百分率均明顯增加；乳鐵蛋白25、50、500 mg可不同程度降低環(huán)磷酰胺處理小鼠外周血CD4+T、CD8+T細胞百分率（P<0.01或P<0.05）。

2.2 乳鐵蛋白對環(huán)磷酰胺處理小鼠Th1/Th2類細胞因子的影響

乳鐵蛋白對環(huán)磷酰胺處理小鼠Th1/Th2類細胞因子的影響，結果見表2。

表2 各組小鼠血清細胞因子變化（±s，n=10）Table 2 Changes of Serum Cytokines in Mice（±s，n=10）

表2 各組小鼠血清細胞因子變化（±s，n=10）Table 2 Changes of Serum Cytokines in Mice（±s，n=10）

注：**p<0. 01；*p<0.05與模型組相比。

分組濃度/（mg/kg）IFN-γ/（pg/mL）IL-2/（pg/mL）IL-4/（pg/mL）IL-10/（pg/mL）IFN-γ/IL-4正常組 133.31±30.14** 29.00±9.03* 42.32±6.40** 54.44±10.56 3.19±0.66**模型組 105.27±24.57 40.04±12.81 59.99±11.85 55.07±11.85 1.76±0.27乳鐵蛋白 5 120.53±17.53 29.31±5.11* 58.93±9.54 46.60±7.98 2.08±0.36乳鐵蛋白 25 109.73±15.01 36.20±5.90 60.29±8.71 47.42±12.85 1.84±0.29乳鐵蛋白 50 113.26±18.62 39.71±8.44 53.97±15.67 51.08±10.76 2.28±0.89*乳鐵蛋白 500 130.01±28.02* 35.39±14.10 55.95±6.45 55.67±16.97 2.36±0.62*

從表2可以看出，模型小鼠血清Th1類細胞因子IFN-γ 明顯降低（p＜0.01）；IL-2 明顯增高（p＜0.05）；乳鐵蛋白500 mg組小鼠血清IFN-γ較模型組明顯增高（p＜0.05）；乳鐵蛋白5 mg組小鼠血清IL-2明顯降低，較模型組差異顯著（p＜0.05）。

模型小鼠血清Th2類細胞因子不同程度增高，特別是IL-4較正常組差異顯著（p＜0.05）；乳鐵蛋白5、50、500 mg小鼠血清Th2類細胞因子IL-4、IL-10有降低趨勢，但與模型組比較，均無顯著性差異。

模型組小鼠血清IIFN-γ/IL-4比值較正常小鼠明顯降低（p＜0.01），與模型組相比，乳鐵蛋白 50、500 mg組小鼠血清IFN-γ/IL-4比值明顯增高（p＜0.05）。結果表明，乳鐵蛋白可使環(huán)磷酰胺致Th1/Th2平衡漂移有所改善。

3 討論

外周淋巴細胞亞群的穩(wěn)定是維持機體正常免疫調節(jié)功能所必需的，是評估機體細胞免疫功能的重要指標。Balb/c小鼠為常用的近交系小鼠，其外周血淋巴細胞約占白細胞總數的60%～80%，這一特點有利于觀察乳鐵蛋白對環(huán)磷酰胺處理小鼠淋巴細胞的影響。CD4+T細胞為輔助性T細胞，可產生多種細胞因子，傳遞抗原信息，促進T和B淋巴細胞增殖分化，輔助B細胞產生抗體和誘導遲發(fā)型超敏反應，在免疫應答中主要起調節(jié)作用；CD8+T細胞為抑制性和殺傷性T細胞，有免疫抑制和細胞毒作用，可抑制CD4+T細胞和B細胞功能，通過自身及抑制因子在免疫反應中起調節(jié)作用[3]。本研究表明，環(huán)磷酰胺處理小鼠外周血CD4+、CD8+T細胞百分率均明顯增加，乳鐵蛋白25、50、500 mg可降低小鼠外周血CD4+T、CD8+T細胞百分率。結果提示乳鐵蛋白對淋巴細胞具有一定的保護作用。

輔助性T細胞（Th）在調節(jié)細胞免疫和體液免疫反應中起關鍵作用，根據分泌細胞因子的不同，Th細胞分為Th1與Th2兩種類型。Th1/Th2細胞因子對細胞免疫和體液免疫均有重要的調節(jié)作用。感染性疾病，自身免疫病，過敏性疾病，移植排斥反應中，均伴有Th1/Th2免疫調節(jié)失衡。IFN-γ和IL-4可以分別代表Th1和Th2免疫應答的水平，IFN-γ生物學功能主要為誘導Th細胞向Th1細胞分化，提高Th1細胞數量及其活力；拮抗IL-4誘導B淋巴細胞增殖及產生IgE、IgG；調節(jié)抗原遞呈細胞參與抗原遞呈和特異性免疫識別過程。IL-4主要促進B細胞的增殖，活化和分化；促進T細胞向Th2型細胞分化；拮抗IFN-γ的分泌和功能。IFN-γ/IL-4的比值變化可代表Th1/Th2免疫平衡狀況[4-6]。

本次實驗結果顯示，環(huán)磷酰胺處理小鼠血清Th1類細胞因子IFN-γ明顯降低；Th2類細胞因子IL-4明顯增高；IFN-γ/IL-4比值明顯下降，由此可以判定環(huán)磷酰胺胺處理小鼠存在明顯的Th1/Th2免疫調節(jié)失衡，乳鐵蛋白50、500 mg對Th1/Th2免疫應答有一定的影響，可通過提高IFN-γ/IL-4比值，促進Th1/Th2免疫平衡的重建，完成其對免疫功能的調節(jié)作用。

乳鐵蛋白是一種具有多種生物功能活性的蛋白質，相關研究表明，乳鐵蛋白具有促進抗體生成、T細胞成熟、淋巴細胞增殖、活化自然殺傷細胞等多種免疫調節(jié)功能[7]。乳鐵蛋白對機體的免疫調節(jié)作用具有深遠的應用前景。

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[1]胡志和,龐廣昌,陳慶森.牛乳鐵蛋白及乳鐵素的生產與應用現狀[J].食品科學,2006,27(6):247-251

[2]胡志和,劉傳國,龐廣昌,等.乳鐵素免疫調節(jié)功能評價[J].食品科學,2009,30(15):200-204

[3]吳亞娣.Th1/Th2細胞的表面受體及其功能調節(jié)[J].上海免疫學雜志,2000,20(5):318-320

[4]顧國浩,彭群新.Th1/Th2細胞的免疫功能變化及其意義[J].國外醫(yī)學:臨床生物化學與檢測學分冊,2003,24(6):333-334

[5]胡志和,劉傳國,龐廣昌,等.乳鐵素免疫調節(jié)功能評價[J].食品科學,2009,30(15):200-204

[6]袁穎,金素安,何世民.中藥對Th1/Th2細胞因子平衡調節(jié)作用的研究進展[J].上海中醫(yī)藥雜志,2011,45(5):90-93

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Protection of Lactoferrin Aganist Immune Injury of Cyclophosphamide in Mice

LI Zhao-xia1，ZHANG Qiu-xia1，ZHAO Hui1，WANG Ping2
（1.School of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Beijing 100069，China；2.Beijing Dong Ming Pharmaceutical Technology Co.，Ltd.，Beijing 100069，China）

Abstract：To observe the protection of lactoferrin aganist immune injury of cyclophosphamide in mice.Balb/c mice were randomly divided into six groups——normal group，model group，four doses of lactoferrin groups.The normal group mice were administrated by saline solution without injection of cyclophosphamide.The model group mice were injected cyclophosphamide after intragastric administration of saline solution 27 days continuously.The four doses of lactoferrin groups mice were injected cyclophosphamide（5，25，50，500 mg/kg） through intraperitoneal injection after intragastric administration of correlative dose of lactoferrin 27 days continuously and then administrated by correlative dose of lactoferrin to the 30th days.After the last administration，peripheral blood CD4+T-cells and CD8+T-cells were measured by radioimmunoassay and the levels of serum cytokines of IL-2，IFN-γ，IL-4 and IL-10 were measured by enzyme-linked immunoassay.In comparison with normal group，the percentage of CD4+T-cells and CD8+T-cells were increased ，the levels of serum IFN-γ were decreased obviously （p<0.01），the levels of serum of IL-4 were increased obviously（p<0.05），the ratio of IIFN-γ and IL-4 was decreased obviously （p<0.01） in model group.Peripheral blood CD4+T-cells and CD8+T-cells were decreased obviously in 25 mg/kg and 50 mg/kg as well as 500 mg/kg doses of lactoferrin （P<0.01 or P<0.05）.The levels of serum of IFN-γ were increased obviously in 500 mg/kg dose of lactoferrin in comparison with model group （p<0.05）.The ratio of IFN-γ/IL-4 was inclined to normal level in 50 and 500 mg/kg doses of lactoferrin groups.The lactoferrin had the protection function of restoration of immune imbalance of mice due to cyclophosphamide.

Key words：lactoferrin；cyclophosphamide；immune function

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.13.032

李朝霞（1977—），女（漢），講師，博士，研究方向：中藥新藥的開發(fā)與應用。

2012-12-17