氧化苦參堿對(duì)體外培養(yǎng)人膀胱癌T24細(xì)胞生長的抑制作用及其機(jī)制

李 順，劉 泉，魏學(xué)斌，黃世明，徐留玉，黃生亮，趙慶利，李 青

(山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院，濟(jì)南 250014)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，手術(shù)切除雖可取得較好的近期療效，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高，3～5年內(nèi)復(fù)發(fā)率為50% ～70%，并且30% ～40%復(fù)發(fā)腫瘤惡性程度增高、浸潤能力增強(qiáng)。膀胱腔內(nèi)灌注化療是當(dāng)前預(yù)防膀胱癌復(fù)發(fā)最常用的方法，但其常用的化療藥物對(duì)癌細(xì)胞殺傷缺乏靶向性，毒副作用大，且存在不同程度的多藥耐藥。因此，尋找高效低毒的灌注藥物對(duì)提高膀胱腫瘤療效具有積極意義。近年研究證實(shí)，氧化苦參堿(OMT)對(duì)體外乳腺癌、胰腺癌等腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用［1，2］。2010年6月～2012年6月，我們觀察了OMT對(duì)體外培養(yǎng)膀胱癌T24細(xì)胞生長的抑制作用，并初步探討其可能機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 膀胱癌T24細(xì)胞，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷教研室惠贈(zèng);OMT，寧夏啟元藥業(yè)有限公司;絲裂霉素 C(MMC)，Kyowa Hakko Kogyo Co.Ltd.;RMPI 1640培養(yǎng)液，Gibco公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)，Sigma公司;蛋白提取試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒，碧云天公司;倒置熒光顯微鏡(Motie，China)，酶聯(lián)免疫分析儀(Techan，Austria)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 人膀胱癌T24細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 將T24細(xì)胞置于含10%新生小牛血清和雙抗RMPI 1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2、飽和濕度的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞配成4×104/mL懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，設(shè)8個(gè)復(fù)孔，接種3板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。以 OMT 0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL 分為 5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，另設(shè)陽性對(duì)照組(MMC 20 mg/L)、陰性對(duì)照組(不加處理因素)、空白對(duì)照組(不加入細(xì)胞，其他同實(shí)驗(yàn)組)，溶劑對(duì)照組(生理鹽水代替處理因素)。加入不同的處理因素作用24 h后，取出1板加入MTT培養(yǎng)4 h，加入 DMSO 200 μL/孔，振蕩溶解。

1.2.2 膀胱癌T24細(xì)胞抑制率檢測(cè) 酶標(biāo)儀用空白對(duì)照組調(diào)零，檢測(cè)波長600 nm處吸光度(OD值)，計(jì)算細(xì)胞存活率和抑制率。存活率=處理組OD值/陰性對(duì)照OD值×100%，抑制率=(1－存活率) ×100%。以 OMT 0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL分為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，作用24、48、72 h后分別取一培養(yǎng)板，測(cè)定OMT在24、48、72 h對(duì)膀胱癌 T24細(xì)胞的抑制率，重復(fù)3次。

1.2.3 膀胱癌T24細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 以 OMT 1.25 mg/mL分為實(shí)驗(yàn)組，設(shè)立陰性對(duì)照組。取膀胱癌T24細(xì)胞制備細(xì)胞爬片，常規(guī)HE染色及瑞氏染色，分別在低倍和高倍鏡及油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并攝相。6孔培養(yǎng)板分兩組(OMT 1.25 mg/mL組、陰性對(duì)照組)加入不同處理因素，培養(yǎng)72 h收集細(xì)胞。分別加入4%戊二醛、1%鋨酸固定，再用乙醇丙酮梯度脫水，618環(huán)樹脂包埋后超薄切片。經(jīng)枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)凋亡細(xì)胞 將細(xì)胞同步化培養(yǎng)24 h，以分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組加入1.25 mg/mL OMT。再培養(yǎng)72 h收集細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，棄去上清液，把細(xì)胞緩慢加入到－20℃預(yù)冷的70%乙醇固定。將等體積的細(xì)胞懸液和PI染液混勻，染色30 min?；旌弦哼^300目尼龍網(wǎng)。把樣品放入FCM的樣品室，以激發(fā)波長為488 nm測(cè)定，并用MODFIT2.0軟件分析細(xì)胞周期分布及凋亡情況。

1.2.5 Western blot檢測(cè) Survivin、Caspase-3 的表達(dá)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)膀胱癌T24細(xì)胞，將OMT按0.625、1.25、2.5 mg/mL 濃度梯度加藥于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)48 h后胰酶消化細(xì)胞，取干預(yù)后的細(xì)胞于EP管。每管加入100 μL細(xì)胞裂解液(含PMSF)吹勻。于冰上放置30 min后，4℃ 14000 g離心10 min，取上清并定量，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。每管取30 μg總蛋白加入上樣緩沖液煮沸 5 min，經(jīng) SDS/PAGE凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。一抗1∶1000稀釋4℃孵育過夜，二抗1∶5000稀釋室溫孵育2 h后，二氨基聯(lián)苯胺顯色并對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度掃描分析。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較行方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn) a=0.05。

2 結(jié)果

2.1 OMT對(duì)T24細(xì)胞增殖的抑制作用 見表1。

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 1.25 mg/mL OMT作用后，光鏡下可見到細(xì)胞變?yōu)椴灰?guī)則狀，體積縮小，胞質(zhì)濃縮，胞核凝聚，染色質(zhì)致密聚集成板塊狀，位于核周膜成新月狀，形成凋亡小體(圖1A)。電子顯微鏡下，癌細(xì)胞核質(zhì)比例縮小，胞質(zhì)濃縮(圖1B)，核染色質(zhì)濃縮呈半月形，染色質(zhì)聚集靠近于核膜周邊，進(jìn)而細(xì)胞膜內(nèi)陷細(xì)胞自行分割為多個(gè)具有完整膜性結(jié)構(gòu)，內(nèi)含各種細(xì)胞成分的凋亡小體(見圖1C)。

2.3 T24細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 FCM分析T24細(xì)胞DNA含量，1.25 mg/mL OMT處理組T24細(xì)胞與陰性對(duì)照組相比，出現(xiàn)G0/G1期阻滯，S期細(xì)胞較陰性對(duì)照組下降(P ＜0.05)，1.25 mg/mL OMT 處理72 h后，G1期前出現(xiàn)呈特征性的亞二倍峰(凋亡峰)。細(xì)胞凋亡率為5.37%。見圖2。

表1 各組不同時(shí)間膀胱癌T24細(xì)胞增殖抑制情況比較(n=3，%)

圖1 1.25 mg/mL OMT作用后光鏡及電鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

圖2 1.25 mg/mL OMT作用72 h后T24細(xì)胞周期分布

2.4 各組Survivin、Caspase-3表達(dá)比較 見圖3、表2。

圖3 Caspase-3、Survivin蛋白免疫印跡帶灰度

3 討論

保留膀胱的膀胱癌術(shù)后患者，2年內(nèi)超過半數(shù)要復(fù)發(fā)，并且有惡性程度增加趨勢(shì)。絲裂霉素C、結(jié)核菌素、阿霉素、喜樹堿等相繼應(yīng)用于膀胱灌注，但復(fù)發(fā)率仍居高不下，并且具有不同程度的毒副作用。因此，尋找高效低毒的灌注藥物具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

表2 各組Survivin、Caspase-3表達(dá)比較()

表2 各組Survivin、Caspase-3表達(dá)比較()

組別 n Caspase-3 Survivin空白對(duì)照組8 0.052 ±0.0018 0.632 ±0.00970.625 mg/mL OMT 組 8 0.084 ±0.0019 0.465 ±0.00751.25 mg/mL OMT 組 8 0.165 ±0.0023 0.257 ±0.00262.5 mg/mL OMT 組 8 0.298 ±0.0087 0.142 ±0.0092 P 0.014 0.008

OMT又名苦參素，分子式為C15H24N2O2·H2O，分子量為282，是從中藥苦豆子中提取的一種生物堿?？喽棺?，別名苦甘草、苦參草、苦豆根及西豆根，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》就已載入藥，全株味極苦、性寒，具有清熱解毒、抗菌消炎作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，OMT有抗腫瘤作用［3］，但國內(nèi)外尚未見其用于膀胱癌的報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，不同濃度OMT隨著濃度的增長、作用時(shí)間的延長對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞的抑制率逐漸增強(qiáng)，1.25 mg/mL OMT對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞的抑制率明顯高于陰性對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、0.625 mg/mL OMT 組(P 均 ＜0.05)，≥2.5 mg/mL OMT各組對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞的抑制率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1.25 mg/mL OMT作用人膀胱癌T24細(xì)胞后，在光鏡、電鏡下均可見到細(xì)胞皺縮，胞質(zhì)濃縮，胞核凝聚，核染色質(zhì)濃縮呈半月形，染色質(zhì)聚集靠近核膜周邊，核仁裂解，細(xì)胞膜內(nèi)陷細(xì)胞自行分割為多個(gè)具有完整膜性結(jié)構(gòu)，內(nèi)含各種細(xì)胞成分的凋亡小體;FCM可見癌細(xì)胞株出現(xiàn)典型的調(diào)亡峰。提示OMT可以誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞的凋亡。

細(xì)胞凋亡機(jī)制十分復(fù)雜，至今尚未完全清楚。近年研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡與凋亡相關(guān)蛋白Survivin、Caspase-3表達(dá)有關(guān)。Survivin基因是新近發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制基因，同時(shí)也是迄今發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的凋亡抑制因子。膀胱癌組織中Survivin表達(dá)量明顯高于正常組織中表達(dá)，且其表達(dá)與膀胱癌患者的臨床分期和腫瘤分化程度均有一定相關(guān)性，在低分化和臨床分期越高的膀胱癌患者中，其表達(dá)水平越高［4］。細(xì)胞凋亡的發(fā)生需激活Caspase。Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶，具有嚴(yán)格的底物特異性，Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中必不可少的蛋白酶，是凋亡發(fā)生的直接限速酶，表達(dá)的高低決定了凋亡的發(fā)生和多少［5，6］。Survivin 蛋白通過 Caspase 通路抑制凋亡，可以直接抑制凋亡終末效應(yīng)器，干擾Caspase 9的活化及Caspase3、Caspase7，從而阻斷各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合p21-cdk4復(fù)合物上的cdk4，釋放的p21與Caspase 3形成復(fù)合物，抑制Caspase 3的活性，從而間接抑制細(xì)胞凋亡。提示Survivin基因可通過多重途徑抑制凋亡，促進(jìn)腫瘤的形成［7，8］。本研究結(jié)果顯示，隨著 OMT濃度升高，Caspase-3蛋白表達(dá)顯著增高，Survivin蛋白表達(dá)顯著下降，并且呈一定的劑量依賴性。提示OMT能明顯抑制T24膀胱癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，其誘導(dǎo)凋亡機(jī)制與抑制Survivin蛋白表達(dá)，提高Caspase-3在的表達(dá)有關(guān)，但其確切機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，OMT對(duì)體外培養(yǎng)人膀胱癌T24細(xì)胞生長有強(qiáng)烈的抑制作用，其機(jī)制可能與抑制Survivin表達(dá)、上調(diào)Caspase-3表達(dá)等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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