應(yīng)用PCR－DGGE技術(shù)研究宰后羊肉經(jīng)不同處理后的微生物動態(tài)變化

賈文婷，蔣彩虹，李開雄，盧士玲

(新疆石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000)

新疆羊肉味道鮮美，富含蛋白質(zhì)、脂肪、人體所需氨基酸等多種營養(yǎng)成分以及鈣和鐵等微量元素［1］。肉制品腐敗變質(zhì)的主要原因是微生物作用和酶的催化作用［2］。了解肉制品中微生物的群落結(jié)構(gòu)和特定腐敗菌有利于控制微生物的生長繁殖，預(yù)測產(chǎn)品的保質(zhì)期以及采用正確的保鮮措施確保產(chǎn)品的安全性［3］。然而，僅運用傳統(tǒng)的微生物研究方法對于準(zhǔn)確了解羊肉貯藏期的腐敗微生物還存在很多困難，因為微生物種和屬之間的顯性特征往往會因為環(huán)境差異而出現(xiàn)交叉表象［4］，選擇性培養(yǎng)基也不能完全模仿肉質(zhì)品的特定營養(yǎng)條件［5］。變性梯度凝膠電泳(DGGE)為研究微生物菌群的動態(tài)變化開辟了新的途徑。目前，PCR－DGGE技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于食品微生物的種群群落研究，但是，應(yīng)用該技術(shù)研究宰后不同處理的冷卻羊肉中腐敗微生物的動態(tài)變化情況還尚未見報道。本實驗將不同處理的羊肉置于相同溫度下貯藏，通過對其細(xì)菌總數(shù)的測定以及PCR－DGGE圖譜分析，來研究冷卻羊肉中主要的微生物，揭示它們在低溫條件下貯藏的動態(tài)變化，探討不同處理方式的羊肉在貯藏期間微生物的變化情況，為延長低溫肉制品的保質(zhì)期和確保產(chǎn)品質(zhì)量安全提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肉 取自新疆石河子市中心農(nóng)貿(mào)市場，為當(dāng)日清晨宰殺后2h的羊肉。電刺激組處理條件為畜體的通電電壓為50V(方波)，頻率為13.8Hz，電刺激時間為60s;吊掛組將羊肉樣品下方懸掛重物吊掛放至于4℃冰箱;空白處理為未經(jīng)任何處理的羊肉樣品。處理后放入 4℃冷庫貯藏。于 0、2、4、6、8、10、12、14、16d 取樣(2 個重復(fù))，測細(xì)菌總數(shù);另外，于 0、2、4、6、8、10、12、14、16d 取樣品(2 個重復(fù))10g 直接用于提取總細(xì)菌DNA。

JL－C2電刺激器 上海中勝科教設(shè)備有限公司;Neofuge臺式高速冷凍離心機 方康發(fā)展有限公司;PCR儀 美國Bio－Rad公司;DGGE電泳儀Biorad Dcode apparatus美國Bio－Rad公司;水平電泳儀 美國Bio－Rad公司;凝膠成像儀GelDoc 2000 system Bio－Rad，美國;電子天平;高速冷凍離心機;Anke TLG－16G小型離心機;Lx－100掌上離心機;Baygene水平電泳儀;SW－CF－1F超凈工作臺;GKYS潔凈工作臺;微型震蕩器;海爾控溫冰箱;高低溫恒溫震蕩培養(yǎng)箱;Eppendorp 移液槍 (1～10μL、1～20μL、20～200μL、10～1000μL);細(xì)菌總 DNA 提取試劑盒QIAGEN，德國;溶菌酶 sigma;PCR相關(guān)試劑盒;Mark III;去離子水 實驗室自制;丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、尿素、Tris、EDTA、甲酰胺、TE、過硫酸胺Sunshine。

1.2 測定方法

1.2.1 細(xì)菌總數(shù)的測定 無菌條件下取25g樣品(2個重復(fù))加入225mL滅菌生理鹽水搖床振搖30min。取1mL上清液依次進行10倍遞增稀釋，選3個合適的稀釋度，每個稀釋度2個重復(fù)，傾注平板。采用PCA培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)48h［6］，計算菌落總數(shù)。每個樣品菌落總數(shù)取平均值后的對數(shù)值(N)。

1.2.2 細(xì)菌總DNA的提取 參照 Ampe等方法［7］，略有修改。無菌操作取樣品10g(2個重復(fù))于90mL生理鹽水中，搖床振搖30min。4℃，2000×g離心5min，取上清液于10000×g，4℃條件下離心15min，取沉淀置于1.5mL離心管，參照 DNA Tissue Kit(QIAGEN，Germany)說明，用該試劑盒提取總的細(xì)菌DNA。所提取DNA溶于TE緩沖液，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，于－20℃條件貯藏。

1.2.3 PCR擴增 第一輪用采用引物參考文獻(xiàn)［8］，上游引物為帶GC夾子的U968，下游引物為L1401。對細(xì)菌16S rDNA的V6～V8區(qū)段進行PCR擴增，擴增出的片段為400bp。

U968－GC 夾子為:5'－CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCGGGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCTTAC－3';

下游引物L(fēng)1401為:5'－CGG TGT GTACAA GAC CC－3'。

上述引物均由上海生物工程有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為25μL，其中包括DNA稀釋液1μL，引物 U968－GC 和 L1401 各 1μL，PCR Mix 12.5μL，ddH2O10.5μL。

PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5min，35個循環(huán)(94℃，1min，56℃，30s，72℃，1min)，最終 72℃ 延伸7min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳檢測后于－20℃條件下貯藏備用。

1.2.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE)DGGE采用Biorad Dcode apparatus電泳儀，聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%(丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺37.5∶1)。變性梯度從35%～55%(100%變性劑含有7mol/尿素和40%甲酰胺)，在 TAE緩沖液中，先 200V電泳10min，后100V恒壓下電泳14h。

1.2.5 EB染色 電泳結(jié)束后，小心取下DGGE膠片，放入 SARB GREEN中染色 30min，之后再將DGGE膠片放入dd H2O中漂洗3次。

1.2.6 成像及分析 將用EB染好的DGGE膠片置于凝膠成像系統(tǒng)下照相。圖像用Quantity one(BIORAD)分析軟件進行分析。

1.2.7 DNA的回收與純化 將EB染色的DGGE膠片置于紫外燈下，用無菌手術(shù)刀切下DGGE膠上相應(yīng)位置的條帶，分別放入1.5mL已滅菌的離心管里，再加入20μL無菌的TE溶液，置于4℃過夜，備用。

1.2.8 DNA的測序 以回收的DNA為模板，取1.5μL為模板DNA進行16s rDNA V6～V8區(qū)域的擴增，細(xì)菌引物為U968(5'－AAC GCG AAG AAC CTT AC－3')，L1401(5'－CGG TGT GTA CAA GAC CC－3')，PCR擴增程序同1.2.3。擴增后的PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖上檢驗，條帶位置在400bp即可證明該回收DNA的存在，之后將剩余PCR產(chǎn)物送于北京三博遠(yuǎn)志測序部進行測序。登陸NCBI，將所得序列與數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行相似性比對［9］。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落總數(shù)

經(jīng)Spass 18.0軟件分析，三個處理組在相同的天數(shù)菌落總數(shù)差異不顯著(p≥0.05)。由表1可見，在4℃貯藏1～15d，吊掛組和電刺激組菌落總數(shù)從103CFU·g－1增至 107CFU·g－1。貯藏 15d，菌落總數(shù)顯著增高，說明貯藏15d以后，由于細(xì)菌的生長繁殖加速，產(chǎn)品開始腐敗變質(zhì)。

表1 不同處理組在貯藏期間的菌落總數(shù)變化lg(CFU/g)Table 1 Changes of microbial counts for different samples during storage(lgCFU/g)

2.2 細(xì)菌總DNA提取結(jié)果

選取不同處理方式的樣品，分別在第0、2、4、6、8、10、12、14、16d 采集樣品，對樣品進行無菌操作后，用細(xì)菌總DNA提取試劑盒提取樣品中細(xì)菌的總DNA，后用16S rDNA的V6～V8可變區(qū)引物(含GC夾子)進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳檢測，獲得約400bp的特異性片段，所有樣品均有較亮的擴增條帶，說明本實驗中樣品的細(xì)菌總DNA提取效果較好，PCR擴增條件合適，可以滿足后續(xù)DGGE電泳分析實驗的需要。

2.3 細(xì)菌DNA的DGGE圖譜及譜帶測序結(jié)果

DGGE圖譜上同一泳道上不同位置的條帶代表不同的微生物種類［10］。對DGGE圖譜上分離的條帶1～12進行割膠、擴增、測序，在NCBI上用BLAST軟件在GenBank中與參考序列進行相似性比對，分析結(jié)果如表2所示，條帶1～12為嗜冷桿菌、葡萄球菌、克雷伯氏菌、假單胞菌、寡養(yǎng)單胞菌、腸桿菌、乳酸桿菌、熱死環(huán)絲菌。其細(xì)菌相似性均達(dá)96%以上。通過采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)，從新疆塔城區(qū)冷卻羊肉中分離和初步鑒定出典型菌株12株，其中乳桿菌2株、熱死環(huán)絲菌2株、假單胞菌屬和腸桿菌科各3株，葡萄球菌屬和酵母菌各1株［11］。本人經(jīng)過實驗，采用分子生物學(xué)技術(shù)，即PCR－DGGE技術(shù)得到了14個條帶，也就是說存在至少14種優(yōu)勢細(xì)菌，但是由于有些條帶較暗，也可能因為實驗技術(shù)手段問題，通過多次的實驗，對條帶進行割膠測序，14個條帶只測出12個，還不能證明于見亮所檢測的12種細(xì)菌全部包含在本人所檢測的細(xì)菌之內(nèi)。

圖1 不同處理組在貯藏期間細(xì)菌的DGGE圖譜Fig.1 DGGE profiles of the bacterial from different groups during storage

圖1和表2表明:樣品在低溫貯藏過程中，微生物具有顯著差異性和動態(tài)演替過程。貯藏2d時，電刺激組具有較高的多樣性:假單胞菌，嗜冷菌，葡萄球菌，克雷伯氏菌等不同種屬的細(xì)菌均被檢測出來。在貯藏14d時，電刺激組微生物菌群發(fā)生變化，第2、3、8條帶消失或減弱，出現(xiàn)了條帶4、5，它們代表了假單胞菌種的細(xì)菌。吊掛組在貯藏第8d時出現(xiàn)了條帶7、8、9、10 變暗，出現(xiàn)了條帶 2、3，它們代表葡萄球菌和克雷伯氏菌屬?？瞻捉M在貯藏第8d時條帶7、8、9、10、11 減弱，出現(xiàn)了條帶4、5、6，它們代表了假單胞菌。肉制品的貯藏過程亦是產(chǎn)品的腐敗過程，隨著貯藏時間延長，大多數(shù)細(xì)菌逐漸受到抑制，主要有4條濃度最高的條帶5、6、7和8存在，它們代表嗜冷菌和假單胞菌，表明它們的主導(dǎo)優(yōu)勢地位;8d時才觀察到條帶2即葡萄球菌，并呈現(xiàn)極高的濃度，說明它是羊肉腐敗時的主要腐敗菌之一。綜上所述，吊掛組與電刺激組在貯藏初期菌群差異不大，主要的腐敗菌均為嗜冷桿菌。在貯藏的后期，假單胞菌成為電刺激組的主導(dǎo)腐敗菌，而吊掛組的主導(dǎo)腐敗菌群為葡萄球菌。出現(xiàn)這種后期差異性的可能原因是電刺激組的羊肉成熟時間比吊掛組要短。在貯藏過程中腐敗的時間比吊掛組要早，所以在貯藏后期出現(xiàn)了較多的條帶。而吊掛組相對成熟時間延長，在貯藏的后期微生物污染較少，只有較少的條帶出現(xiàn)，葡萄球菌占主導(dǎo)地位。

表2 DGGE條帶分離的主要細(xì)菌16S rDNA部分序列相似性比較Table 2 Comparison of partial 16S rDNA sequencing fragments of dominating microbe similarity from DGGE bands

通過圖2表明:不同處理方式的羊肉在低溫貯藏過程中污染的微生物也存在差異性。由圖2系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，菌2和10的親緣關(guān)系比較近，菌2是在吊掛組貯藏后期出現(xiàn)的細(xì)菌，菌10是空白組貯藏初期出現(xiàn)的細(xì)菌;菌1和7，8是同一屬的菌群，它們分別在電刺激組和吊掛組的貯藏初期出現(xiàn)，菌8在電刺激組的貯藏后期仍然存在;菌4和5，6是同一屬的菌群，菌4和5屬于電刺激組后期出現(xiàn)的特有菌群，菌6是在空白組貯藏后期出現(xiàn)的菌群，它們均未在吊掛組檢測到，具體原因尚未清楚，需要進一步的研究。由于DNA測序只能精確到屬，所以要想更加準(zhǔn)確的確定這些細(xì)菌到底隸屬于哪一種還要進行后續(xù)實驗。

本實驗證明了不同處理方式羊肉貯藏過程中微生物的動態(tài)變化，無論是吊掛處理還是電刺激處理，都有其相應(yīng)的變化規(guī)律，電刺激組在貯藏后期微生物菌群以假單胞菌為主要腐敗菌，吊掛組以葡萄球菌為主要腐敗菌。并且在最初的時期也是存在多樣性的。而產(chǎn)生這些菌群變化差別的具體原因尚不清楚，未見國內(nèi)外研究報道。

圖2 冷卻羊肉貯藏一定時間后經(jīng)DGGE分析后所分離純化細(xì)菌的微生物進化樹Fig.2 Dendrogram of the DGGE profiles obtained directly from the cooling mutton at some days of ripening

3 結(jié)論

本文應(yīng)用PCR－DGGE指紋技術(shù)，研究了不同處理方式冷卻羊肉中微生物的多樣性及其貯藏過程中的菌群動態(tài)變化。變性梯度凝膠電泳技術(shù)能有效地應(yīng)用于低溫肉制品中微生物的研究，直觀地反映肉制品中主要微生物群落及其動態(tài)變化過程。

結(jié)果表明，冷卻羊肉貯藏初期污染微生物就已經(jīng)具有較高多樣性，但是隨著貯藏時間的增加，其優(yōu)勢逐漸被少數(shù)腐敗菌所代替，這些腐敗菌具有很強的競爭優(yōu)勢，從而抑制了其他微生物的生長，造成了冷卻羊肉的腐敗變質(zhì)。兩個處理組在儲藏初期微生物菌群差異不大，但吊掛組在第10d后以葡萄球菌為主導(dǎo)菌群。電刺激組在貯藏過程后期才凸顯的腐敗菌為假單胞菌。

［1］秦瑞升，谷雪蓮，劉寶林.不同貯藏溫度對速凍羊肉品質(zhì)影響的實驗研究［J］.食品科學(xué)，2007，28(8):495.

［2］Laduda T P.Shelf－life dating of foods［M］.Westport CT:Food and Nutrition Press，1982.

［3］Hansen L T，HussH H.Comparison of the microflora isolated from spoiled cold2smoked salmon from three smokehouses［J］.Food Res Int，1998，31:703－711.

［4］Holley R A.Impact of slicing hygiene upon shelf life and distribution of spoilage bacteria in vacuum packaged cured meats［J］.Food Microbiol，1997，14:201－211.

［5］Muyzer G，deWall E C，Uitterlinden A G.Profiling of comp lexmicrobial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction－amplified genes coding for 16S rRNA［J］.Appl EnvironMicrobiol，1993，59:695－700.

［6］白艷紅.低溫熏煮香腸腐敗機理及生物抑菌研究［D］.楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué)，2005:42－52.

［7］Giraffa G，Neviani，E.DNA－ based，culture－ independent strategies for evaluating microbial communities in food－associated ecosystems［J］.International Journal of Food Microbiology，2001，67:19－34.

［8］M Y Li，G H.Zhou，X L Xu，et al.Changes of bacteria diversity and main flora in chilled pork during storage using PCR－DGGE［J］.Food Microbiology，2006，23:607－611.

［9］Altschul S F，Madden TL，Schaffer AA，et al.Gapped blast and psiblast:a new generation of protein database search programs［J］.Nucleic Acids Research，1997，25:3389－3402.

［10］Ercolini G.PCR－DGGE fingerprinting:novel strategies for detection of microbes in food review［J］.Journal of Microbiological Methods，2004，56:297－341.

［11］于見亮，李開雄，蒲菊霜，等.冷卻羊肉中腐敗菌的分離、初步鑒定與初始菌相分析［J］.肉類工業(yè)，2007(11):27－29.