羅非魚下腳料蛋白水解液制備鋅蛋白鹽的研究

孔美蘭，吉宏武，章超樺

（1.韓山師范學(xué)院生物系，廣東潮州 521041；2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

眾所周知，鋅是已知的人體14種必需微量元素之一，由于其在人體內(nèi)廣泛的生理生化作用而被稱為“生命元素”[1]。人類鋅絕對(duì)缺乏比較少見，但邊緣性鋅缺乏常見。這些人群容易缺鋅的主要原因在于他們由于生理需要對(duì)鋅的需求量較大而日常膳食中的鋅攝入不足以及生物利用率較低，這就造成機(jī)體處于鋅缺乏狀態(tài)。因此，研究出高生物利用率的鋅蛋白鹽具有很現(xiàn)實(shí)的意義[2]。鋅蛋白鹽具有高生物利用率、無毒、無刺激作用，適口性好等優(yōu)點(diǎn)[3-4]，成為近幾年來鋅補(bǔ)劑的研究熱點(diǎn)。氨基酸微量元素絡(luò)合物作為飼料添加劑研究較多，但作為食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑研究較少[5-6]。羅非魚（Tilapia）被視為傳統(tǒng)白肉魚種的替代品種，正日漸受到歐美市場(chǎng)青睞。國(guó)際市場(chǎng)對(duì)羅非魚的巨大需求推動(dòng)了國(guó)內(nèi)羅非魚產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。其中羅非魚片出肉率不到40%，在其加工過程中產(chǎn)生大量的加工廢棄物，如何綜合利用這些廢棄物，增加附加值，減少環(huán)境污染是今后要解決的難題[7]。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，以鋅的螯合率為指標(biāo)，采用經(jīng)過超濾處理的羅非魚下腳料蛋白水解液與無機(jī)鋅離子進(jìn)行螯合反應(yīng)，以制備高生物利用率的鋅蛋白鹽。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

羅非魚下腳料（包括魚頭、魚骨刺、魚內(nèi)臟）廣東湛江國(guó)溢水產(chǎn)品有限公司；羅非魚下腳料超濾液自制；無水乙醇、EDTA、茚三酮、ZnSO4·5H2O、醋酸鋅、ZnCl2等試劑 均為分析純。

HJ-4型多頭磁力加熱攪拌器 上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；pHS-25型酸度計(jì) 上海偉業(yè)公司；FA2104S分析天平 上海天平儀器廠；TIANFANGTP-10-20型超濾裝置 天津膜天膜工程技術(shù)有限公司；10DX-FTIR型紅外光譜儀 美國(guó)Nicolet。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

利用羅非魚下腳料水解蛋白超濾液為復(fù)合氨基酸和小肽來源，與Zn2+在水溶液中進(jìn)行反應(yīng)以合成鋅蛋白鹽。

1.2.1 復(fù)合氨基酸液的制備[8]將下腳料洗凈，絞成肉糜，500g分裝作為待測(cè)樣品，于-18℃凍藏備用。酶解時(shí)，將原料取出用自來水解凍，按以下條件進(jìn)行自溶水解。水解條件為：pH7.5，50℃，料液質(zhì)量比1∶3，時(shí)間6.5h。水解完成后沸水浴15min滅酶，離心所得的酶解液即為復(fù)合氨基酸液。

1.2.2 超濾液的制備 對(duì)復(fù)合氨基酸液進(jìn)行超濾處理，超濾采用TO10-20蠕動(dòng)泵，超濾膜的孔徑為2.5nm，工作壓力為0.05MPa，流量為10～12L/h，超濾后蛋白水解液的分子量在6000u以下。

1.2.3 鋅蛋白鹽的螯合工藝[3]羅非魚下腳料水解蛋白超濾液→加入無機(jī)鋅鹽→調(diào)節(jié)pH→水浴加熱→4000r/min，離心5min→取上清液減壓濃縮→濃縮液加入5倍體積無水乙醇→4000r/min，離心5min→取沉淀，冷凍干燥后得到鋅蛋白鹽。

1.2.4 鋅的螯合率的測(cè)定方法 鋅含量的測(cè)定[4]：采用EDTA絡(luò)合滴定法。

式中：C—標(biāo)準(zhǔn)EDTA溶液的濃度，mol/L；V1—滴定螯合態(tài)鋅元素所消耗的EDTA溶液體積，mL；V0—滴定鋅元素總量所消耗的EDTA溶液體積，mL。

1.2.5 螯合方式

1.2.5.1 單因素實(shí)驗(yàn) 配位比對(duì)螯合率的影響[10]：在螯合條件為：90℃、1h、pH6.0，研究配位比對(duì)鋅螯合率的影響。

pH對(duì)螯合反應(yīng)的影響：在螯合條件為：90℃、1h、配位比為2∶1，研究pH對(duì)鋅螯合率的影響。

螯合時(shí)間的影響：在螯合條件為：90℃、pH6.0、配位比為2∶1，考查時(shí)間對(duì)螯合率的影響。

反應(yīng)溫度對(duì)螯合反應(yīng)的影響：由于螯合反應(yīng)為吸熱反應(yīng)，溫度對(duì)螯合物的生成具有一定的影響。實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)溫度為40～90℃，溫度間隔為10℃，在螯合條件為：10min、pH6.0、配位比為2∶1，考查溫度對(duì)鋅螯合率的影響。

不同鋅鹽對(duì)螯合率的影響：實(shí)驗(yàn)選用醋酸鋅、氯化鋅、硫酸鋅為實(shí)驗(yàn)鋅源，確定不同鋅源對(duì)螯合率的影響。在螯合條件為：10min、pH6.0、配位比為2∶1、70℃，考查鋅源對(duì)鋅螯合率的影響。

1.2.5.2 正交實(shí)驗(yàn) 通過單因素實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析，目的進(jìn)一步考慮各因素的綜合影響，對(duì)影響螯合反應(yīng)的四個(gè)主要因素：反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)pH、配位比設(shè)計(jì)了四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，其因素和水平如表1所示。

表1 螯合正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Levels and factors of chelation orthogonal test

1.2.6 鋅蛋白鹽的分離與定性分析[11]

1.2.6.1 螯合物的分離 本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)溶劑無水乙醇來分離提純水溶性的鋅蛋白鹽，V無水乙醇∶V鋅蛋白濃縮液=5∶1。這是由于鋅蛋白鹽在乙醇、丙醇、丙酮等有機(jī)溶劑中的溶解度極小，而游離金屬離子、氨基酸和小肽均能溶于乙醇等有機(jī)溶劑中，利用這一特性，不僅可以制得高純度的鋅蛋白鹽，而且有利于對(duì)螯合物的進(jìn)一步研究，同時(shí)有機(jī)溶劑的回收利用可有效地降低成本。

1.2.6.2 定性分析 稱取經(jīng)冷凍干燥的鋅蛋白鹽結(jié)晶少量，加KBr研磨，烘干后再研磨均勻壓片，同時(shí)稱取經(jīng)冷凍干燥的蛋白水解超濾液按前述方法壓片，用10DX-FTIR型紅外光譜儀測(cè)定，光譜掃描范圍4000～400cm-1，分辨率8cm-1。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用正交設(shè)計(jì)助手II v 3.1軟件對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 配位比對(duì)螯合反應(yīng)的影響

圖1 配位比對(duì)螯合率的影響Fig.1 Effect of the AA/Zn2+ratio on ability of chelation

由圖1可知，當(dāng)原料配位比小于2∶1時(shí)，螯合反應(yīng)進(jìn)行不完全，螯合率偏低；當(dāng)原料配比處于2∶1和2.5∶1之間時(shí)，鋅螯合率已基本達(dá)到最大；當(dāng)原料配比大于2.5∶1時(shí)，螯合率有所下降，說明過高增加氨基酸和小肽的濃度不利于鋅蛋白鹽的形成。而且當(dāng)配位比太大時(shí)生成的分子量過大，由于其穩(wěn)定性過強(qiáng)難以為生物體所吸收利用。因此，選擇2∶1的原料配比作最佳實(shí)驗(yàn)條件合成鋅蛋白鹽。既能保證獲得足夠穩(wěn)定的螯合物，又能充分利用氨基酸和小肽，降低成本。

2.2 pH對(duì)螯合反應(yīng)的影響

由圖2可知，隨著pH的增大，鋅的螯合率緩慢增大，當(dāng)pH達(dá)到6時(shí)，螯合率最高，繼續(xù)增加pH，螯合率急劇下降。由此可見，pH為6.0時(shí)鋅的螯合率最大。

圖2 pH對(duì)螯合率的影響Fig.2 Effect of pH on ability of chelation

2.3 螯合時(shí)間的影響

由圖3可知，螯合反應(yīng)在10min時(shí)就結(jié)束了。之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，螯合率呈下降趨勢(shì)。這是由于螯合反應(yīng)是快速反應(yīng)，但是在70℃這樣的溫度下，新形成的螯合物也會(huì)部分分解還原為復(fù)合氨基酸、小肽和鋅無機(jī)鹽。因此，螯合時(shí)間確定為10min。

圖3 時(shí)間對(duì)螯合率的影響Fig.3 Effect of time on ability of chelation

2.4 反應(yīng)溫度對(duì)螯合反應(yīng)的影響

由圖4可知，隨著螯合溫度的升高，螯合率呈上升的趨勢(shì)，當(dāng)溫度超過70℃時(shí)，螯合率開始下降。這是由于螯合反應(yīng)為吸熱反應(yīng)，因而反應(yīng)溫度越高對(duì)反應(yīng)越有利，但若反應(yīng)溫度過高，則容易破壞肽及其螯合物的結(jié)構(gòu)；若反應(yīng)溫度太低，則螯合反應(yīng)速度較慢且收率較低，所以選擇反應(yīng)溫度為70℃，此時(shí)鋅的螯合率最高。

圖4 溫度對(duì)螯合率的影響Fig.4 Effect of temperature on ability of chelation

2.5 不同鋅鹽對(duì)螯合率的影響

由圖5可知，硫酸鋅作為鋅源更有利于鋅蛋白鹽的合成，氯化鋅次之，乙酸鋅最差。

圖5 不同鋅源對(duì)螯合率的影響Fig.5 Effect of zinc sources on ability of chelation

2.6 鋅蛋白鹽螯合條件的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，螯合影響因素由主到次依次是：A、D、C、B；螯合的最優(yōu)方案是：A2B3C3D1；即最佳螯合條件是：pH6.0，80℃，14min，配位比為1.5∶1。

表2 螯合實(shí)驗(yàn)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and result of chelation trial condition

采用正交設(shè)計(jì)助手II v3.1軟件對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。pH對(duì)應(yīng)的F比比F臨界值大。表明pH對(duì)鋅蛋白鹽螯合效果影響顯著（p＜0.05）。再根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求對(duì)最優(yōu)方案進(jìn)行驗(yàn)證，鋅蛋白鹽螯合率為68.12%，高于正交實(shí)驗(yàn)表2中最高抑制率。因此，確定鋅蛋白鹽螯合的最佳工藝條件是：pH6.0，80℃，14min，配位比為1.5∶1。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3 Analysis of variance for the results of orthogonal array experiment

2.7 鋅蛋白鹽的性質(zhì)鑒定

2.7.1 螯合物的初步鑒定 鋅蛋白鹽是一種白色粉末狀固體，無異味，易溶于水，不溶于乙醇等有機(jī)溶劑，室溫下穩(wěn)定存在。

將精制的鋅蛋白鹽粉末溶于水，得淡黃色溶液，加入茚三酮，溶液顏色由淡黃色變?yōu)榫萍t色。同時(shí)做空白對(duì)比實(shí)驗(yàn)：羅非魚下腳料蛋白水解液遇茚三酮變成藍(lán)紫色，符合α-氨基酸與茚三酮的典型顯色反應(yīng)。這一顯著的顏色變化初步說明鋅蛋白鹽水溶液中的氨基酸和小肽不是以游離形式存在的，制備的螯合物溶液不是ZnSO4與復(fù)合氨基酸、小肽的簡(jiǎn)單物理組合，且用有機(jī)溶劑沉淀出的固態(tài)螯合物沉淀溶于水，也有別于水不溶性的鋅蛋白鹽。由此可初步推斷產(chǎn)物為鋅與氨基酸和小肽的螯合物。

2.7.2 螯合物的紅外光譜分析 羅非魚下腳料水解蛋白和鋅蛋白鹽的紅外光譜分別如圖6和圖7所示。由圖6～圖7可知，羅非魚下腳料水解蛋白中由氨基（-NH2）的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起的3072.84cm-1和2964.95cm-1的特征吸收。在水解蛋白與鋅螯合后，螯合物的紅外光譜顯示，氨基的特征吸收峰仍然存在，但紅移至3347.94cm-1處，說明水解蛋白中的氨基參與了配位反應(yīng)。另外，水解蛋白在2124.2cm-1的吸收峰，經(jīng)絡(luò)合之后該峰在鋅蛋白鹽的紅外譜圖中消失了，這與文獻(xiàn)報(bào)道的α-氨基酸在2100cm-1處有一特征吸收峰，絡(luò)合之后該峰就消失的結(jié)論相符，進(jìn)一步說明了鋅蛋白鹽的形成[12]。

圖6 羅非魚下腳料蛋白自溶水解產(chǎn)物紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectrum of auto-hydrolyzate of byproduct of Tilapia

圖7 鋅蛋白鹽的紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectrum of zinc proteinate

3 結(jié)論

經(jīng)過超濾處理的羅非魚下腳料蛋白水解液與無機(jī)鋅離子螯合成鋅蛋白鹽。實(shí)驗(yàn)采用單因素和正交實(shí)驗(yàn)，考察了螯合pH、溫度、時(shí)間、鋅源、配位比對(duì)鋅的螯合率的影響，最終確定了最佳螯合條件是：pH6.0，80℃，14min，配位比為1.5∶1，螯合率為68.12%。

鋅蛋白鹽粉末溶于水，加入茚三酮，溶液顏色由淡黃色變?yōu)榫萍t色。同時(shí)做空白對(duì)比實(shí)驗(yàn)：羅非魚下腳料蛋白水解液遇茚三酮變成藍(lán)紫色，符合α-氨基酸與茚三酮的典型顯色反應(yīng)。這一顯著的顏色變化初步說明鋅蛋白鹽水溶液中的氨基酸和小肽與鋅離子是以螯合態(tài)存在的。采用紅外光譜法對(duì)鋅蛋白鹽進(jìn)一步定性分析。氨基的特征吸收峰發(fā)生了紅移，說明水解蛋白中的氨基參與了配位反應(yīng)。另外，水解蛋白在2124.2cm-1的吸收峰，經(jīng)絡(luò)合之后該峰在鋅蛋白鹽的紅外光譜圖中消失了，從而進(jìn)一步說明了鋅蛋白鹽的形成。

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