閃式提取法提取棗果皮中多酚的工藝研究

張 迪，王 勇，王彥兵，3，劉繡華，2，*

（1.河南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院環(huán)境與分析科學(xué)研究所，河南開封475004；2.河南大學(xué)化學(xué)生物學(xué)研究所，河南省天然藥物與免疫工程重點實驗室，河南開封475004；3.河南福森藥業(yè)有限公司，河南淅川 474405）

棗（Zizyphus jujube dates），又名大棗、華棗，是鼠李科棗屬植物棗樹的果實[1]，在我國已有四千多年的種植歷史。紅棗作為藥食同源食物，不僅具有豐富的營養(yǎng)，還有很強(qiáng)的保健作用[2]。多酚類化合物作為大棗重要的功能性成分之一，主要包括沒食子酸、綠原酸、兒茶素、肉桂酸，槲皮素、蘆丁等[3]，它們具有清除機(jī)體自由基、抗病毒、抗腫瘤、消炎、抑制細(xì)菌生長等多種生物學(xué)活性。因此可以為食品添加劑、藥品、化妝品開發(fā)、生物材料研制等提供天然的食品防腐劑和天然抗氧化劑，具有廣闊的應(yīng)用前景[4-6]。由于多酚類化合物不穩(wěn)定，易氧化，因而快速、高效的提取方法是降低棗果皮中多酚損失的關(guān)鍵[7]。目前報道的有關(guān)多酚提取方法主要有超聲波提取法，回流提取法等?；亓魈崛》ㄊ窃谳^高溫度下進(jìn)行，容易導(dǎo)致多酚的氧化，并且超聲和回流提取法耗時較長，因而開發(fā)一種快速高效的提取方法具有較高的應(yīng)用價值[8-10]。閃式提取是在適當(dāng)溶劑條件下，利用高速機(jī)械剪切力和超速動態(tài)分子滲透作用，使組織細(xì)胞內(nèi)部的有效成分迅速達(dá)到組織內(nèi)外平衡，進(jìn)而達(dá)到快速提取目的的一種方法，具有高效節(jié)能、操作簡便、利于環(huán)保等優(yōu)點[11-12]?；诖耍緦嶒炓砸掖?水為提取溶劑，通過單因素實驗和正交實驗確定提取棗果皮中多酚的最佳條件，并采用Folin-Ciocalteu分光光度法測定提取物中多酚的含量，以期為紅棗深加工過程中產(chǎn)生的棗果皮廢棄物進(jìn)行綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棗果皮 河南新鄭好想你棗業(yè)股份有限公司；沒食子酸 遵義市林原化工有限責(zé)任公司，純度＞99.0%；乙醇，碳酸鈉，所用化學(xué)試劑 均為分析純，使用前未進(jìn)一步純化；水 為二次蒸餾水。

JHBE-50S型閃式提取器 河南金鼎科技有限公司；Lab Tech UV-BlueStra型紫外可見分光光度計北京萊伯泰科儀器有限公司；BS210S型電子分析天平 北京賽多利斯公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；TDL-5-A型臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ-50E型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Folin-Ciocalteu（FCR）試劑 稱取5g鉬酸鈉和20g鎢酸鈉置于250mL圓底燒瓶中，用150mL蒸餾水溶解，加入85%的磷酸溶液10mL和20mL濃鹽酸，加熱回流10h，然后加入30g硫酸鋰及15mL雙氧水，加熱沸騰20min至亮黃色，冷卻并稀釋至0.5L，貯于棕色瓶中于4℃冰箱中保存[13]。

1.2.2 閃式提取棗果皮中多酚的工藝流程 棗果皮→干燥（自然風(fēng)干至恒重）→粉碎（60目）→閃提→離心→抽濾→濃縮至無醇味→蒸餾水定容至250mL容量瓶中。

1.2.3 超聲波法提取棗果皮中的多酚[9]稱取2.00g棗果皮，以料液比1∶15（g/mL），加入60%乙醇30mL，超聲提取2次，每次提取60min，提取結(jié)束后處理同1.2.2。

1.2.4 多酚得率的測定 多酚得率（mg/g）=提取的多酚質(zhì)量（mg）/原料質(zhì)量（g）

多酚含量的測定：采用Folin-Ciocalteu分光光度法[13]。準(zhǔn)確取提取液1mL于10mL具塞試管中，各加3mL水，搖勻，再加1.5mL福林試劑，充分搖勻。然后加入20%碳酸鈉溶液3mL，混勻后定容，在30℃水浴中避光反應(yīng)30min，水做空白對照，用1cm×1cm的比色皿在760nm處測定吸光度；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=99.50x+0.00909（R2=0.9992），計算棗果皮中多酚的含量。

1.2.5 提取條件的選擇 研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間、提取次數(shù)對棗皮中多酚提取的影響，以多酚得率為評價指標(biāo)進(jìn)行研究和分析，首先做單因素實驗，考察以上條件對多酚得率的影響，然后采用正交實驗法優(yōu)化最佳工藝條件。

1.2.5.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇 準(zhǔn)確稱取6份粉碎的棗果皮樣品各2.0000g置于250mL閃式提取器中，分別加入60mL乙醇溶液作為溶劑，控制乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%、80%，設(shè)定提取時間為2min，提取1次，進(jìn)行閃式提取。浸提液經(jīng)減壓抽濾，取一定體積溶液并按1.2.4步驟測定，在760nm處測定吸光度，計算多酚得率。

1.2.5.2 料液比的選擇 準(zhǔn)確稱取6份粉碎的棗果皮樣品各2.0000g置于250mL閃式提取器中，分別加入體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液40、50、60、70、80、100mL作為溶劑，設(shè)定提取時間為2min，提取1次，進(jìn)行閃式提取。浸提液經(jīng)減壓抽濾，取一定體積溶液并按1.2.4步驟測定，在760nm處測定吸光度，計算多酚得率。

1.2.5.3 提取時間的選擇 準(zhǔn)確稱取6份粉碎的棗果皮樣品各2.0000g置于250mL閃式提取器中，加入70mL 60%的乙醇溶液作為溶劑，設(shè)定提取1次，分別控制提取時間0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0min進(jìn)行閃式提取。浸提液經(jīng)減壓抽濾，取一定體積溶液并按1.2.4步驟測定，在760nm處測定吸光度，計算多酚得率。

1.2.5.4 提取次數(shù)的選擇 準(zhǔn)確稱取5份粉碎的棗果皮樣品各2.0000g置于250mL閃式提取器中，加入70mL 60%的乙醇溶液作為溶劑，設(shè)定提取時間為2min，分別提取1、2、3、4、5次。浸提液經(jīng)減壓抽濾，取一定體積溶液并按1.2.4步驟測定，在760nm處測定吸光度，計算多酚得率。

1.2.5.5 最佳工藝條件的選擇 為獲得以乙醇溶液作為溶劑，閃式提取棗果皮中多酚的最佳工藝條件，通過研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間、提取次數(shù)等單因素，確定3個水平進(jìn)行L9（34）實驗如表1所示，以多酚得率為指標(biāo)，探究閃式提取棗果皮中多酚的最佳工藝條件。

表1 正交實驗因素及水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚得率的影響Fig.1 Effect of volume fraction of ethanol on extraction rate of polyphenolics

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對棗果皮中多酚得率的影響 在料液比1∶35（g/mL），提取時間2min，提取1次的條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚得率的影響如圖1所示。結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%時，得率達(dá)到最大值，之后隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加多酚得率反而逐漸減小。因多酚類物質(zhì)在植物中以氫鍵和疏水鍵的形式與蛋白質(zhì)、多糖結(jié)合成穩(wěn)定的化合物存在于植物細(xì)胞內(nèi)，有機(jī)溶劑可以破壞細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞，并具有氫鍵斷裂的作用使多酚大量溶出。但當(dāng)乙醇濃度高于60%時，由于醇溶性雜質(zhì)“色素”等親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加，與多酚類化合物競爭同溶劑結(jié)合，從而導(dǎo)致多酚的提取得率下降[14]。所以乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時的提取效果好。故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%三個水平進(jìn)行優(yōu)化。

2.1.2 料液比對棗果皮中多酚得率的影響 在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取時間2min，提取1次的條件下，料液比對多酚得率的影響如圖2所示。結(jié)果表明，多酚的得率隨著料液比的增加而逐漸增加且趨于平緩。由于提取液體積的增大會增加蒸發(fā)濃縮的能耗和工耗，為降低分離純化的成本，因此選擇料液比1∶30、1∶35、1∶40三個水平進(jìn)行優(yōu)化。

圖2 料液比對多酚得率的影響Fig.2 Effect of the ratio of water to materials on extraction rate of polyphenolics

2.1.3 提取時間對棗果皮中多酚得率的影響 在料液比1∶35（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取1次的條件下，提取時間對多酚得率的影響如圖3所示。結(jié)果表明，在3min時，多酚得率最大，在此之后得率隨時間的延長而逐步下降，可能的原因是隨著時間的延長，提取過程中發(fā)熱，由于多酚類物質(zhì)的熱穩(wěn)定性較差，長時間受熱發(fā)生氧化或水解反應(yīng)所致[15]。故選擇提取時間2、3、4min三個水平進(jìn)行優(yōu)化。

圖3 提取時間對多酚得率的影響Fig.3 Effect of extracting time on extraction rate of polyphenolics

2.1.4 提取次數(shù)對棗果皮中多酚得率的影響 在料液比1∶35（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取時間2min的條件下，提取次數(shù)對多酚得率的影響如圖4所示。結(jié)果表明，隨著提取次數(shù)的增加，多酚的得率逐漸增大且趨于平緩，但溶劑的消耗量增大，考慮到經(jīng)濟(jì)效益諸多方面的因素，故選擇提取次數(shù)為1、2、3次三個水平進(jìn)行優(yōu)化。

圖4 提取次數(shù)對多酚得率的影響Fig.4 Effect of extraction times on extraction rate of polyphenolics

2.2 正交實驗結(jié)果與分析

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取影響棗果皮多酚提取因素中有意義的水平做正交實驗，對結(jié)果進(jìn)行極差分析，以確定最佳提取工藝條件。設(shè)計L9（34）正交實驗，實驗結(jié)果見表2。由表2數(shù)據(jù)極差分析可知，閃提次數(shù)對多酚得率的影響顯著，提取時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚得率的影響較小，料液比對多酚得率的影響最小，且都不顯著。從正交實驗結(jié)果極差分析可知，棗果皮中多酚的最佳提取工藝為A2B2C1D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶35（g/mL），提取時間2min，提取3次。

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

2.3 閃式提取棗果皮中多酚的驗證實驗

按照選定的條件A2B2C1D3重復(fù)實驗3次，得率分別為13.59、13.64、13.63mg/g，平均值為13.62mg/g，均高于表2中其他組合的多酚得率，說明優(yōu)化的提取工藝是合理的。

2.4 與超聲波提取結(jié)果對比

按照實驗方法1.2.3提取棗果皮中的多酚，與閃式提取的最佳提取工藝進(jìn)行比較，結(jié)果見表3。由表3可知，閃式提取棗果皮中多酚比超聲波法提取的多酚得率高27.53%。方差分析結(jié)果表明，閃式提取法多酚得率和超聲波提取法多酚得率存在顯著性差異。因此閃式提取依靠在提取時間大大縮短的同時又提高了多酚的得率，這為棗果實深加工過程中產(chǎn)生的廢棄物綜合利用提供了一定的理論依據(jù)。

表3 閃式提取與超聲波提取比較Table 3 Comparison of the results of flash extraction and ultrasonic extraction

3 結(jié)論

采用閃式提取法對棗果皮中的多酚進(jìn)行提取，由單因素實驗得出各因素對多酚得率的影響程度為：提取次數(shù)＞提取時間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比，通過正交實驗優(yōu)化了棗果皮中提取多酚的工藝條件，最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶35（g/mL），提取時間2min，提取3次，此條件下多酚的得率為13.62mg/g。該提取工藝與超聲波法相比，閃式提取的多酚得率大大提高。因此，閃式提取法是提取棗果皮中多酚的一種快速高效的提取方法，具有較高的應(yīng)用價值。

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