平車前無性系建立的研究

王曉旭，夏鴻飛，李 慧，姜長陽

(遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116081)

平車前(Plantago depressa)又名大葉車前、車輪菜、牛舌草等，為車前科車前屬多年生草本植物。平車前為臨床上的常用中藥，全草和種子均可入藥［1］。平車前有清熱、利尿、明目、祛痰等功效，用于治療小便黃少、暑濕泄瀉、尿路感染、目赤澀痛、痰多咳嗽等疾?。?－3］。現(xiàn)代研究證實，平車前除具有以上功效外，還具有止瀉護(hù)肝、降壓、抑菌、降低血清膽固醇等多種藥理作用［4］。在臨床上平車前主要用于治療水腫、慢性活動性肝炎、隱匿性腎炎［5］、陰道炎等癥。此外，平車前還可作為野菜食用和畜禽的青飼料。車前屬植物多數(shù)分布于受人為干擾強(qiáng)烈的生境中，是理論生態(tài)學(xué)、生理生態(tài)學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)研究的理想材料［6］。研究者的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由于平車前具有重要的藥用、食用和飼用價值，多年來的大量采挖和生存環(huán)境的破壞，導(dǎo)致近年來野生平車前資源的分布和數(shù)量都急劇減少，現(xiàn)在，在大連郊區(qū)已經(jīng)很難采到野生平車前。因此，尋求平車前快速繁殖的方法顯得尤為重要。此前已有許多關(guān)于車前植物的研究報道［7－12］，多集中于其藥用價值及成分分析方面，迄今未見平車前無性系建立的報道。本次試驗針對平車前愈傷組織增殖和分化進(jìn)行研究，篩選出適合平車前無性系建立的最佳條件，進(jìn)而建立平車前的無性系，有利于平車前的大量繁殖，獲得好的經(jīng)濟(jì)價值及生態(tài)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與滅菌及培養(yǎng)條件

將采自大連郊區(qū)山坡上的平車前植株用清水沖洗干凈后，根和葉柄剪成5 cm左右的段狀，葉片剪成若干5 cm左右的小塊狀后，放到磨口廣口瓶中，用自來水振蕩洗滌10 min，之后用體積分?jǐn)?shù)為0.05%安利洗滌液洗滌約10 min，再用自來水振蕩洗滌3～5次至材料無泡沫。將材料置于超凈工作臺上，用體積分?jǐn)?shù)為70%～75%的乙醇滅菌12s左右后，迅速用無菌水振蕩洗滌3～5次，再加入濃度為0.05%的HgCl2溶液浸泡滅菌14 min，緊接著用無菌水洗滌4～5次即獲得無菌材料。MS培養(yǎng)基中蔗糖含量為30 g·L－1，1/2MS 培養(yǎng)基中蔗糖含量為 15 g·L－1，瓊脂含量為 4.5 g·L－1，pH 5.8 ～6.0，每日持續(xù)光照12 h，光照強(qiáng)度為2 000Lx，培養(yǎng)溫度為24℃。

1.2 方法

1.2.1 不同生長素對根、葉片和葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將無菌材料中的根和葉柄剪成長0.5 cm左右的小段，葉片剪成邊長為0.5 cm左右的小塊。剪取材料時，盡可能取幼嫩部位。將以上3種材料分別接種于添加不同生長素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)，材料先置于暗箱中培養(yǎng)15 d，再置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d。每種培養(yǎng)基每種材料接種培養(yǎng)30個。

1.2.2 不同濃度配比的6－BA和2，4－D對平車前葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將無菌的平車前葉柄剪成0.5 cm左右的小段，接種到附加不同濃度6－BA和2，4－D的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基接種培養(yǎng)40個材料，先置于暗箱中培養(yǎng)15 d，再置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d。試驗重復(fù)3次。觀察平車前葉柄的出愈情況，45 d后統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.3 不同濃度6－BA、2，4－D 和 NAA 配比對愈傷組織增殖的影響

將在 MS+6－BA0.2mg/L+2，4－D2.0 mg/L+蔗糖30 g/L培養(yǎng)基上初代培養(yǎng)的愈傷組織分成0.4～0.5 cm左右的塊狀后，接種在附加不同濃度6－BA、2，4－D和NAA配比的增殖培養(yǎng)基上，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行平車前愈傷組織的增殖培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基接種50個材料，每種處理重復(fù)3次。觀察愈傷組織的生長情況，45 d后統(tǒng)計愈傷組織的增殖狀況。

1.2.4 不同濃度6－BA、KT和NAA對愈傷組織分化的影響

以MS為基本培養(yǎng)基、附加不同濃度的6－BA、KT和NAA，設(shè)計出12種培養(yǎng)基，將 MS+6－BA0.2 mg/L+NAA2.0mg/L+蔗糖30 g/L這一培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)后顏色嫩綠的愈傷組織接種到各種培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種100個直徑約為0.5cm的愈傷組織團(tuán)塊，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行為期45 d的愈傷組織分化培養(yǎng)并統(tǒng)計分化率，此試驗重復(fù)2次。把分化培養(yǎng)的平車前不定芽從基部剪下，接種到與顆粒狀愈傷組織分化培養(yǎng)相同的培養(yǎng)基上，進(jìn)行不定芽的分化繼代培養(yǎng)。

1.2.5 不同生長素對平車前不定芽生根的影響

將上述繼代分化培養(yǎng)的不定芽從基部剪下，接種到以1/2MS為基本培養(yǎng)基，分別附加 IAA 0.2 mg/L、IBA 0.2 mg/L、NAA 0.2 mg/L、2，4 － D 0.2 mg/L 和蔗糖 15 g/L 的培養(yǎng)基上。接種時不定芽植物學(xué)下部的生長點插入培養(yǎng)基，于變溫光照條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基接種培養(yǎng)45個材料，試驗重復(fù)2次。

1.2.6 煉苗移栽

將培養(yǎng)著生長旺盛，根系發(fā)達(dá)試管苗的培養(yǎng)瓶打開瓶塞，將試管苗轉(zhuǎn)移到有水的燒杯中，置于陽光不能直射的實驗臺上，煉苗3d后移栽到上半層分別為干凈河沙、爐灰渣和園土，下半層為肥沃園土的溫室花盆中，移栽試驗重復(fù)2次，共移栽300株。

2 結(jié)果

2.1 不同生長素對根、葉片和葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的影響

外植體接種10 d后，葉片邊緣及葉柄、根兩端切口出現(xiàn)膨大，已形成白色的愈傷組織;暗箱中培養(yǎng)15 d后，轉(zhuǎn)到光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在以2，4－D為生長素的培養(yǎng)基上愈傷組織顏色慢慢轉(zhuǎn)為嫩黃色(見圖1)。45 d后統(tǒng)計，結(jié)果見表1。由表可見以葉柄為外植體愈傷組織誘導(dǎo)率優(yōu)于葉片和根，葉片的誘導(dǎo)率要高于根。單獨使用2，4－D的誘導(dǎo)效果最好，NAA次之，單獨使用IBA和IAA兩種生長素幾乎不能誘導(dǎo)這三種平車前材料形成愈傷組織。隨著誘導(dǎo)時間的延長，含有NAA的培養(yǎng)基愈傷組織會分化成根。試驗結(jié)果表明，葉柄是平車前愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體，2，4－D是平車前愈傷組織誘導(dǎo)的最佳生長素。

圖1 誘導(dǎo)的平車前愈傷組織Fig.1 The induction of callus

表1 不同生長素對不同材料愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.1 The effects of different auxin on callus induction of different explants

2.2 不同濃度配比的6－BA和2，4－D對平車前葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表2可見，接種培養(yǎng)的平車前葉柄在所有培養(yǎng)基中都能誘導(dǎo)形成愈傷組織，每種培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率都達(dá)到了100%。但從愈傷組織的生長速度和愈傷組織的長勢看，4號培養(yǎng)基誘導(dǎo)形成的愈傷組織生長速度快、長勢好。接種在這種培養(yǎng)基上的葉柄，培養(yǎng)10d左右外植體兩端切口開始出現(xiàn)愈傷組織，隨后愈傷組織開始迅速生長。初期形成的愈傷組織外表光滑、淺黃色的半透明狀，培養(yǎng)到45d變成直徑為0.2cm左右黃綠色顆粒狀。觀察還表明，當(dāng)2，4－D濃度過高時，抑制愈傷組織生長。6、7號培養(yǎng)基出現(xiàn)水浸狀愈傷組織，可能與其生長素濃度較高有關(guān)。因此，MS+6－BA0.2mg/L+2，4－D2.0 mg/L+蔗糖30 g/L 是愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。注:+++為長勢好，++為長勢較好，+為長勢一般。

表2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.2 The effects of different hormone combinations on callus induction of stripes

2.3 不同濃度6－BA、2，4－D和NAA配比對愈傷組織增殖的影響

接種10 d后可見愈傷組織開始慢慢增大。由表3可看出，試驗所用的培養(yǎng)基均能夠不同程度的使愈傷組織增殖。觀察結(jié)果表明，雖然2，4－D是誘導(dǎo)平車前愈傷組織的最佳生長素，但卻不適合愈傷組織繼代培養(yǎng)。在3號培養(yǎng)基即附加了濃度為0.2 mg/L 6－BA和濃度為2.0 mg/L NAA、基本培養(yǎng)基為MS的培養(yǎng)基上，愈傷組織的增殖速度最快，所培養(yǎng)出的顆粒狀愈傷組織質(zhì)地疏松，并呈有光澤的嫩綠色(見圖2)，生長速度較快，試驗證明此種愈傷組織具有分化能力。把在3號培養(yǎng)基上培養(yǎng)45d的愈傷組織，在相同培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)3代，所形成的愈傷組織的外觀仍然保持不變。以上試驗表明，MS+6－BA0.2 mg/L+NAA2.0 mg/L是平車前愈傷組織增殖的理想培養(yǎng)基。

圖2 愈傷組織的增殖培養(yǎng)Fig.2 The proliferation of callus

表3 不同生長調(diào)節(jié)劑配比對愈傷組織增殖的影響Tab.3 The effects of different hormone combination on callus proliferation

2.4 不同濃度6－BA、KT和NAA對愈傷組織分化的影響

由表4可以看出，在不加激素、只單加6－BA、KT兩種細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中平車前顆粒狀愈傷組織均不能分化，而在不同濃度配比的6－BA和NAA，KT和NAA的培養(yǎng)基中，平車前的顆粒狀愈傷組織會不同程度地分化出根(見圖3)。由此也可以看出，平車前愈傷組織可能含有較多的內(nèi)源生長素。但添加三種激素的培養(yǎng)基中，愈傷組織分化出了不定芽。在添加6－BA 1.0 mg/L、KT1.0 mg/L和NAA0.5 mg/L的培養(yǎng)基上，分化培養(yǎng)到14d左右時，愈傷組織顆粒即可分化出可見芽點。分化培養(yǎng)到45d時，不僅顆粒狀愈傷組織的分化率達(dá)到了87%，每個愈傷組織顆粒還會分化形成為有3～7個不定芽組成的長勢較好叢生不定芽。但在光照不強(qiáng)的情況下，愈傷組織會因為花青素較多而變成紫紅色(見圖4)。把上述分化培養(yǎng)形成的叢生不定芽從基部剪下，接種到相同的培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽的分化培養(yǎng)。經(jīng)過3次重復(fù)試驗證明，不定芽經(jīng)過45d培養(yǎng)，平均每個培養(yǎng)的不定芽可分化生長出高5 cm以上的不定芽5.7個。以上試驗表明，MS+6 － BA1.0 mg/L+KT1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+蔗糖30 g/L是愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基。

圖3 分化出根的愈傷組織Fig.3 Differentiation out of the root of callus

圖4 分化后出現(xiàn)花青素的愈傷組織Fig.4 Anthocyanins in callus

表4 不同濃度6－BA、KT和NAA對愈傷組織分化的影響Tab.4 The effects of different hormone combination on callus differentiation

2.5 不同生長素對平車前不定芽生根的影響

28 d觀察統(tǒng)計，結(jié)果見表5。在添加IAA培養(yǎng)基上生根率為100%且試管苗長勢最好。觀察發(fā)現(xiàn)，在添加IAA培養(yǎng)基上，不定芽培養(yǎng)至第8 d開始生根，從平均生根數(shù)、根長以及苗長勢等方面看，變溫條件下有利于平車前生長芽生根的生長素依次為IAA、NAA、IBA和2，4－ D。因此，IAA是平車前生長芽生根的最佳生長素。

表5 生長芽變溫光照下生根情況Tab.5 The rooting situation of Plantago depressa with poikilothermal illumination

2.6 移栽

移栽后30 d統(tǒng)計證明:移栽的理想基質(zhì)為園土，移栽成活300株，成活率為100%。

定植后30 d統(tǒng)計證明:定植成活 100株，成活率100%。定植成活的試管苗生長良好，當(dāng)年開花結(jié)果，保持了野生平車前的植物學(xué)性狀(見圖5)。

圖5 移栽的試管苗Fig.5 Tube seedlings of transplanting

3 討論

對于愈傷組織的誘導(dǎo)，取材部位［13］，生理狀態(tài)及外植體大小都會影響培養(yǎng)結(jié)果。在植物的組織培養(yǎng)中用于愈傷組織誘導(dǎo)的外植體一般取自幼嫩部位或新生長的器官組織，如幼嫩的葉片、根、花、莖段、塊根和塊莖等。本次研究發(fā)現(xiàn)，葉柄是平車前愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體，根和葉片不適合愈傷組織誘導(dǎo)。將培養(yǎng)材料置于暗培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)7d后取出進(jìn)行光照培養(yǎng)，這樣操作更有利于愈傷組織的誘導(dǎo)［14］。平車前愈傷組織的誘導(dǎo)也需要進(jìn)行暗培養(yǎng)，直接進(jìn)行光照培養(yǎng)會引起外植體的死亡。誘導(dǎo)愈傷組織，2，4－D的生長調(diào)節(jié)活性最強(qiáng)，NAA次之，IAA和IBA的作用較弱較差［15］。本次研究證明，平車前愈傷組織的誘導(dǎo)的最佳生長素是 2，4 －D。MS+6－BA0.2 mg/L+2，4－D2.0 mg/L+蔗糖30 g/L是平車前葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，MS+6 －BA0.2 mg/L+NAA2.0 mg/L+蔗糖30 g/L是平車前愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基。在愈傷組織分化培養(yǎng)的過程中，最好是先誘導(dǎo)分化出芽，因為形成芽后在其基部很容易形成根。但愈傷組織先分化形成根則會抑制芽的形成［16］。生長素/細(xì)胞分裂素比例決定著芽和根的分化。一般來說，當(dāng)生長素比細(xì)胞分裂素比值高時，有利于根的生長，比值低時有利于芽的生長，中間比值利于愈傷組織的誘導(dǎo)和分化［17－18］。本次研究發(fā)現(xiàn)，在不同濃度配比的6－BA和NAA，KT和NAA的培養(yǎng)基中，平車前的顆粒狀愈傷組織會不同程度地分化出根。只有在添加6－BA、NAA和KT三種激素的培養(yǎng)基中，平車前愈傷組織分化出了不定芽，分化的最佳培養(yǎng)基為MS+6－BA1.0 mg/L+KT1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+蔗糖30 g/L。分化培養(yǎng)的愈傷組織需要充足的光照，在試驗過程中，由于光照不足有的愈傷組織會因為細(xì)胞含有較多的花青素而呈現(xiàn)紫紅色。

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