水晶肘花長白斑現(xiàn)象的微生物分析

高 鵬，王 艷，何 江，伍 玲，謝 艷，伏 毅，黃 敏

（四川省原子能研究院，四川成都 610101）

豬肉是目前人們餐桌上重要的動物性食品之一，能提供優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和必需的脂肪酸。以豬皮和瘦豬肉為原料的水晶肘花是對豬皮進行的深加工產(chǎn)品，潔白晶瑩，味道鮮香，含有豐富的蛋白質(zhì)，深受人們喜愛[1]。但因肉制品營養(yǎng)豐富，水分活度較高，腐敗菌微生物容易生長和繁殖，加上加工所用的原輔料種類繁多、來源復雜，源頭污染和二次污染難以徹底控制，如只采用傳統(tǒng)的高溫法處理，一部分耐熱微生物仍能殘存，極易導致肉制品發(fā)生微生物性腐敗[2]。一些肉制品在腐敗前會出現(xiàn)白斑現(xiàn)象，這些白斑的形成原因是什么？白斑是否由腐敗微生物引起？是否與產(chǎn)品的腐敗有直接的關系？如何預防白斑的產(chǎn)生？解決這些問題對肉制品生產(chǎn)企業(yè)來說就顯得尤其重要。本文將對水晶肘花長白斑現(xiàn)象進行初步的微生物分析。以往腐敗微生物的檢測大多數(shù)是根據(jù)菌落形態(tài)及生理生化特征來確定其類型[3]。該方法存在耗時長（一般的腐敗微生物檢測需要2～5d），操作繁瑣，結(jié)果不夠準確的缺點[4]。而PCR技術(shù)（聚合酶鏈式反應）所具有的特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優(yōu)點，可以彌補該檢測方法的不足。本文將傳統(tǒng)培養(yǎng)和16S rDNA序列分析方法相結(jié)合，對正常和長白斑的肘花產(chǎn)品中的微生物通過普通培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)后進行分離、純化，然后進行16S rDNA鑒定，比較產(chǎn)品變質(zhì)前后微生物種類的變化，推測引起產(chǎn)品長白斑的微生物原因，為企業(yè)在實際生產(chǎn)中解決問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

正常以及長白斑的水晶肘花產(chǎn)品 成都市某食品廠提供；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（分離和純化好氧和兼性厭氧菌）和厭氧培養(yǎng)基（分離和純化厭氧和兼性厭氧菌）購于北京奧博星生物科技有限公司；瓊脂糖、EDTA、Goldview、dNTPs、TaqDNA聚合酶 上海生物工程有限公司；TIANamp Bacteria DNA kit、Universal DNA Purification kit 天根生化（北京）有限公司；16S rDNA引物 正向5’-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’，反向5’-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3’，上海英駿生物技術(shù)有限公司。

PCR儀、瓊脂糖電泳系統(tǒng)、凝膠成像儀 美國Bio-rad公司；離心機 德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 產(chǎn)品中微生物的分離和純化[4]按照國標GB 4789.2-2010[5]的方法分別處理正常和長白斑樣品，并進行梯度稀釋。需氧菌和厭氧菌的培養(yǎng)按以下方法進行。

1.2.1.1 需氧菌培養(yǎng) 將接種了各稀釋度樣品的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基于36℃培養(yǎng)48h后，挑取不同形態(tài)（顏色、大小等）的代表性菌落進行分離純化。

1.2.1.2 厭氧菌培養(yǎng) 將接種了各稀釋度樣品的厭氧瓊脂培養(yǎng)基，采用燭缸法和焦性沒食子酸法相結(jié)合在密封的干燥器中36℃培養(yǎng)48h。挑取不同形態(tài)（顏色、大小等）的代表性菌落進行分離純化。

1.2.2 形態(tài)特征

1.2.2.1 菌落特征 包括菌落表面形狀、菌落表面（干燥、濕潤）、菌落大小、邊緣形狀、菌落顏色。

1.2.2.2 菌體形態(tài) 包括是否有芽孢、芽孢位置、是否膨大、具體形狀。

1.2.3 16S rDNA特征序列分析

1.2.3.1 微生物的分離和基因組DNA提取 挑取的單菌落進行富集培養(yǎng)，取1.5mL培養(yǎng)液，用TIANamp Bacteria DNA kit（細菌基因組DNA提取試劑盒）提取基因組DNA。

1.2.3.2 細菌16S rDNA序列擴增 用細菌16S rDNA引物進行PCR擴增。50μL反應體系：10×PCR buffer 5μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，25mmol/L MgCl24μL，Taq DNA聚合酶0.25μL，上、下游引物各1μL，ddH2O 32.75μL，模板DNA 2μL。反應程序：94℃預變性5min，94℃變性60s，55℃退火60s，72℃延伸90s，32個循環(huán)，72℃延伸8min[6]。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，Universal DNA Purification kit（DNA純化回收試劑盒）膠回收后，置于-20℃儲藏備用。

1.2.3.3 16S rDNA序列的測定 PCR產(chǎn)物的測序工作由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.3.4 序列分析 測序結(jié)果提交NCBI GenBank進行BLAST相似序列檢索，使用Clustal X1.83軟件進行比對，再用MEGA 5軟件包構(gòu)建進化樹。

1.3 生理生化特征

包括淀粉水解，氧化酶實驗，產(chǎn)氣實驗，運動性，M.R和V.P實驗，木糖發(fā)酵，葡萄糖發(fā)酵，硝酸鹽還原、檸檬酸鹽還原，精氨酸雙水解酶，好氧性，生長溫度、pH和耐鹽性等。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化結(jié)果

接種了各稀釋度樣品的平板在36℃培養(yǎng)48h后，綜合營養(yǎng)瓊脂和厭氧兩種培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)（大小、顏色），挑取有代表性菌落進行分離純化，對照組和白斑組分別得到14個純化后的菌株。圖1為在36℃培養(yǎng)48h后部分營養(yǎng)瓊脂平板的菌落情況。

圖1 部分平板在36℃培養(yǎng)48h后的菌落情況（稀釋度為10-1）Fig.1 Partofcoloniesinplatesafter48hat36℃（Diluted10times）

2.2 菌落特征

分離純化后細菌的菌落特征見表1。

根據(jù)表1中的菌落形態(tài)和菌體特征結(jié)果，可以判斷對照組中分離到的細菌主要為革蘭氏陰性桿菌，而白斑組中除了分離到桿菌屬細菌，同時包括革蘭氏陽性的芽孢桿菌，還需進一步對這些菌株進行鑒定。

2.3 16S rDNA序列分析

分別以兩組樣品中分離純化到的28株菌株的總DNA為模板，用16S rDNA引物進行PCR擴增，得到片段大約為1500bp的PCR產(chǎn)物，經(jīng)測序得到各菌株的16S rDNA序列。各序列在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫Blast比對后，從GeneBank下載親緣關系相近種的模式菌株（或已發(fā)表菌株）序列，基于16S rDNA序列，對28個菌株及下載菌株的16S rDNA序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，以Neighbor-Joining分析法，經(jīng)過500次計算，得到系統(tǒng)發(fā)育關系樹。

表1 各細菌的菌落特征Table 1 Colony characteristics of the strains

續(xù)表

表2 對照組中分離細菌16S rDNA序列分析Table 2 16S rDNA sequence analysis of bacteria isolated from Control group

將對照組中分離到的14株菌的16S rDNA序列經(jīng)Blast比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)遺傳距離確定其最相似菌株，結(jié)果見表2，圖2表示14株菌的系統(tǒng)發(fā)育分析。

圖2 基于16SrDNA序列同源性的對照組14株細菌系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of 16S rDNA sequence of 14 strains in Control group

從表2和圖2的結(jié)果可以看出，經(jīng)過16S rDNA鑒定，對照組分離到的14株菌均為嗜中溫菌的腸桿科細菌，包括Pantoea sp.和包括Enterobacter cloacae、Enterobacter ludwigii在內(nèi)的Enterobacter sp.。其中，A1和A14均為泛團菌屬的一株細菌，與Uncultured Pantoea sp.（HQ616298.1）和Pantoea sp.的相似度為99%以上；A2、A3、A5、A7、A8和A10均屬于陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae（JQ038222.1）），相似度99.95%以上；A4，A6和A11均屬于路德維希腸桿菌（Enterobacter ludwigii（JN700134.1）），相似度99%以上；A9、A12和A13均屬于腸桿菌屬的細菌，與Enterobacter sp.（GU808435.1）相似度為99.95%以上。

將白斑組中分離到的14株菌的16S rDNA序列經(jīng)Blast比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)遺傳距離確定其最相似菌株，結(jié)果見表3（其中B3測序失?。?，圖3表示13株菌的系統(tǒng)發(fā)育分析。

表3 白斑組中分離細菌16S rDNA序列分析Table 3 16S rDNA sequence analysis of bacteria isolated from group with white spots

圖3 基于16SrDNA序列同源性的白斑組13株細菌系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic analysis of 16S rDNA sequence of 13 strains in group with white spot

從表3和圖3的結(jié)果中可以看出，白斑組測序成功的13株菌主要分為兩類，其中6株在對照組中也分離到，包括Enterobacter ludwigii和Enterobacter cloacae在內(nèi)的Enterobacter sp.腸桿菌屬細菌，剩余7株為包括蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）在內(nèi)的芽孢桿菌屬細菌（Bacillus sp.），B1、B5和B7與Bacillus cereus（JN400121.1）相似度99.95%以上，屬于蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）的一種，B2、B6、B8和B11與Bacillus sp.相似度99%以上，同屬于芽孢桿菌屬。根據(jù)以上結(jié)果分析，對照組只分離到腸桿菌，而白斑組除了腸桿菌外，還分離得到包括蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）在內(nèi)的芽孢桿菌屬細菌（Bacillus sp.），推測肘花肉制品長白斑可能是由芽孢桿菌引起的。

2.4 生理生化特征

根據(jù)16S rDNA序列分析結(jié)果，從對照組和白斑中挑選5株細菌進行生理生化特征鑒定，結(jié)果見表4。

綜合生理生化特征和16S rDNA鑒定結(jié)果，可以進一步確認A7和B9為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae），B1和B5為蠟樣芽孢桿菌，B6為其他種的芽孢桿菌。因此，白斑組中存在而對照組沒有的這些芽孢桿菌可能是引起產(chǎn)品長白斑的主要原因。

芽孢桿菌（Bacillus sp.）廣泛存在于自然界中，因此在食品的加工過程中很容易污染食品[7]。芽孢桿菌能利用糖類、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)素成分生長，能形成內(nèi)生孢子，具有較強耐受力，特別是耐熱力。食品加工中滅菌或熟制工藝難以將芽孢桿菌完全殺滅，使得該屬細菌成為食品工業(yè)中較為重要的微生物研究對象[2]。大量研究也表明芽孢桿菌是肉制品中的常見腐敗菌，具有較強的耐高溫能力。肉制品經(jīng)過熟制加工后，一般仍有殘留，隨著貯存時間的延長，最終會大量繁殖，進而導致產(chǎn)品的感官質(zhì)量發(fā)生變化。

錢昆等[2]從低溫熏煮香腸中分離得到一株主要腐敗菌，經(jīng)過16S rDNA鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；徐世明等[4]通過脹袋烤雞中的腐敗菌相研究，分離出5株腐敗菌，利用生理生化結(jié)合16S rDNA序列分析對分離菌株進行鑒定，其中為兩株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和兩株短小芽孢桿菌（Bacillus pumilu）。有學者研究發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）和食物長白斑有著直接的關系[8]，蠟樣芽孢桿菌也是一種廣泛存在于土壤、空氣、水和塵埃中的好氣、中溫、產(chǎn)芽孢的桿菌，是食品和化妝品中常見的污染菌[9-10]。董雙品[8]在長有白色斑點的豆腐和水源中均分離出同一種蠟樣芽孢桿菌，從而證明蠟樣芽孢桿菌在污染水源后，在豆腐中繼續(xù)增殖，從而引起豆制品變質(zhì)，出現(xiàn)白色斑點。肘花產(chǎn)品長白斑引起的腐敗變質(zhì)是否也是由蠟樣芽孢桿菌引起，或者是其他芽孢桿菌作用的結(jié)果，在接下來的研究中，我們將進一步驗證。

表4 菌株的生理生化特征Fig.4 Physiological and biochemical characteristics of the strains

3 結(jié)論

本研究通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法從正常組和長白斑的肘花樣品中分別分離到14株細菌，通過分離純化，結(jié)合16S rDNA序列分析鑒定，對照正常組主要包括泛團菌屬（Pantoea sp.）和包括Enterobacter cloacae、Enterobacter ludwigii在內(nèi)的腸桿菌屬（Enterobacter sp）。白斑組組中除了Enterobactercloacae、Enterobacter ludwigii在內(nèi)的腸桿菌屬（Enterobacter sp）外，還分離出7株包括蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）在內(nèi)的芽孢桿菌屬細菌（Bacillus sp.），因此，推測這些芽孢桿菌可能是引起產(chǎn)品長白斑的主要原因。

本研究對白斑肘花產(chǎn)品中腐敗菌的分離鑒定，將為下一步進行腐敗菌的溯源分析提供依據(jù)，為企業(yè)尋找產(chǎn)品污染源頭，在加工過程中加以重點控制，加強產(chǎn)品品質(zhì)提供保障。

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[3]張小軍，寇曉虹，郝彥玲，等.PCR技術(shù)檢測啤酒中腐敗菌的研究進展[N].華夏酒報，2007-03-14.

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[5]GB/T 4789.2-2010，食品衛(wèi)生微生物學檢驗-菌落總數(shù)測定[S].

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