羧甲基殼聚糖包覆薏苡仁油脂質(zhì)體包覆率測定方法的研究

白春清，熊 華，羅國偉，史 卿，鐘紅蘭，阮 霞，趙士強(qiáng)，趙 強(qiáng)

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047）

薏苡仁為禾本科（Gramineae）薏苡屬（Coix L.）草本植物薏苡（Coix lachryma-jobi Linn）的成熟種仁[1]。作為藥食同源性食物，薏苡仁在亞洲地區(qū)有上千年的食用及藥用歷史，其營養(yǎng)豐富且具有健脾、補(bǔ)肺、清熱、利濕等功效，《本草綱目》中稱其乃上品養(yǎng)心藥[2]。薏苡仁油為薏苡仁中提取的脂溶性物質(zhì)，其含量約為薏苡仁的2%～7%，國內(nèi)外研究證實(shí)薏苡仁油具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、降血脂等功能[3－6]。但薏苡仁油口服吸收生物利用率低，且易氧化分解，限制了其在食品及醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用和發(fā)展[2]。脂質(zhì)體是一種新型的納米膠囊制備技術(shù)，多用于藥物和功能性成分的載體，其脂質(zhì)雙分子結(jié)構(gòu)可將脂溶性成分載入，改善油溶性物質(zhì)的親水性及其在胃腸道中的生物利用率[7－8]。但常規(guī)脂質(zhì)體易出現(xiàn)穩(wěn)定性差，聚集、分層現(xiàn)象，長期存放易引起藥物滲漏等問題[7]。若以水溶性聚合物對常規(guī)脂質(zhì)體進(jìn)行包覆，可在其表面形成保護(hù)膜，減少脂質(zhì)體與周圍環(huán)境的交互作用，提高常規(guī)脂質(zhì)體及薏苡仁油的穩(wěn)定性[9]。羧甲基殼聚糖是殼聚糖經(jīng)羧甲基化而制得的水溶性多糖，其良好的生物相容性、可降解性、無免疫原性及無毒等優(yōu)點(diǎn)，使其成為包覆薏苡仁油脂質(zhì)體的首選水溶性聚合物[10－11]。羧甲基殼聚糖對常規(guī)脂質(zhì)體的包覆效果將直接影響脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。但是目前國內(nèi)關(guān)于羧甲基殼聚糖包覆脂質(zhì)體的文獻(xiàn)報(bào)道較少[12－13]，而現(xiàn)有文獻(xiàn)中對包覆率這一重要指標(biāo)又無從考查，這對制備高質(zhì)量的聚合物包覆脂質(zhì)體來說無疑是一個(gè)缺陷。本實(shí)驗(yàn)在查閱眾多文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上得知硫氰鐵銨分光光度法是測定磷脂含量比較準(zhǔn)確簡單的方法，采用該方法測定未包覆脂質(zhì)體中磷脂含量及總磷脂含量，即可在側(cè)面定量測定包覆率。為了得到未包覆脂質(zhì)體及準(zhǔn)確定量出脂質(zhì)體中的磷脂，本文擬采用離心法將未包覆脂質(zhì)體與包覆脂質(zhì)體分離，用乙醇－超聲法對未包覆脂質(zhì)體破壁令脂質(zhì)體中的磷脂充分釋放并經(jīng)氯仿提取后，通過硫氰鐵銨法測定的磷脂含量，再根據(jù)總磷脂的含量計(jì)算包覆率，為更好地評價(jià)聚合物包覆脂質(zhì)體包覆效果提供簡捷準(zhǔn)確的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

蛋黃卵磷脂 沈陽仙峰科技發(fā)展有限公司；膽固醇 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；薏苡仁油 廣州合誠三仙生物科技有限公司；羧甲基殼聚糖 上海晶純試劑有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯化鐵、氯仿 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫氰酸銨 浙江溫州化學(xué)用料廠。

THZ－82恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司；超聲波發(fā)生器 上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；RE－52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化科技儀器廠；SHB－3循環(huán)水多用真空泵 鄭州杜甫儀器廠；紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TDL－5－A臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；BS224S分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 包覆脂質(zhì)體的制備[14]按照磷脂∶膽固醇=3∶1稱取膜材及適量薏苡仁油，向其中加入適量的乙醇溶解，用蠕動(dòng)泵將其注入到pH6.8的磷酸緩沖液中，于45℃振蕩水化20min后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，超聲處理30min得常規(guī)脂質(zhì)體懸液，將其注入到羧甲基殼聚糖溶液中，磁力攪拌60min后，間歇超聲處理8min得羧甲基殼聚糖包覆脂質(zhì)體。

1.2.2 測定波長的確立 根據(jù)硫氰鐵銨不溶于氯仿，但其與磷脂反應(yīng)生成的紅色絡(luò)合物能溶于氯仿，且在某個(gè)波長處有最大吸收，而磷脂與薏苡仁油等在此處無吸收或吸收很小，通過測定該絡(luò)合物的吸光度即可測定脂質(zhì)體中磷脂的含量[14－15]。對于脂質(zhì)體而言磷脂是構(gòu)成其囊壁的主要成分，本實(shí)驗(yàn)采用乙醇破壁法將脂質(zhì)體的囊壁破壞，充分釋放出所有磷脂，然后采用硫氰酸銨法測定磷脂的含量。

溶液的配制：參照林筱琦等[15]的方法分別配制濃度皆為1mg/mL的磷脂、薏苡仁油溶液。按照1.2.1分別制備未包覆的空白脂質(zhì)體及薏苡仁油脂質(zhì)體。

測定波長的確立：精密吸取1mg/mL蛋黃磷脂溶液0.6mL置于試管中，加硫氰鐵銨溶液8.0mL，再補(bǔ)加氯仿，使試管中氯仿的最終體積為8.0mL。將上述溶液轉(zhuǎn)移至25mL的分液漏斗中，充分振搖，靜置，取下層，以氯仿為空白，在紫外可見分光光度計(jì)上于300～600nm范圍內(nèi)掃描，分別取相同體積的薏苡仁油，用乙醇－超聲破壁的未包覆空白脂質(zhì)體及薏苡仁油脂質(zhì)體，采用同樣的方法處理并進(jìn)行掃描。

1.2.3 處理?xiàng)l件的確定 影響測定吸光度的關(guān)鍵因素包括包覆脂質(zhì)體與未包覆脂質(zhì)體是否完全分離、脂質(zhì)體的壁是否完全打開等。本實(shí)驗(yàn)以吸光度為指標(biāo)，確定離心條件及破壁條件。

破壁條件確定：結(jié)合文獻(xiàn)資料[16]及預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇乙醇－超聲法對常規(guī)脂質(zhì)體進(jìn)行破壁，并對乙醇用量及超聲時(shí)間對吸光度的影響進(jìn)行考察，確定破壁條件。

離心條件的確定：包覆脂質(zhì)體與常規(guī)未包覆脂質(zhì)體，能否完全分離，是影響準(zhǔn)確測定的先決條件，以離心速度和離心時(shí)間對吸光度的影響進(jìn)行了考察。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取1mg/mL的磷脂溶液0.08、0.16、0.32、0.48、0.64、0.80mL置于試管中，其余按照1.2.2的方法操作，以氯仿為空白，在1.2.2所確定的測定波長處測定吸光度A，以A對濃度C（mg/mL）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 回收率實(shí)驗(yàn)[16]精確稱取磷脂1mg/mL，按配方[14]加入膽固醇、薏苡仁油、羧甲基殼聚糖適量，制備包覆脂質(zhì)體。精密吸取包覆脂質(zhì)體混懸液0.6mL，按1.2.3項(xiàng)下確定的條件進(jìn)行離心分離及破壁處理后按照1.2.2的操作測定未包覆脂質(zhì)體中磷脂的含量。另精確稱取磷脂1mg/mL，用氯仿溶解之后按1.2.2操作。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算磷脂含量及方法回收率。

1.2.6 精密度及重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 按照1.2.5的方法制備包覆脂質(zhì)體混懸液及磷脂溶液，分別于同日不同時(shí)間及不同日精密吸取包覆脂質(zhì)體混懸液及磷脂溶液適量，按1.2.3項(xiàng)下條件打開未包覆包覆脂質(zhì)體，以下操作同1.2.2。并按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算磷脂含量，測定方法的精密度和重現(xiàn)性。

1.2.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值以3次實(shí)驗(yàn)的均值表示，選取a=0.05進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 最大吸收波長的確定

從圖1中得知，磷脂與硫氰鐵銨產(chǎn)生的絡(luò)合物在470nm處有最大吸收（圖1－a），而薏苡仁油脂質(zhì)體、空白脂質(zhì)體和磷脂溶液峰形一致（圖1－b、c），薏苡仁油在470nm處吸收為負(fù)值，說明樣品中的薏苡仁油對磷脂含量測定基本無干擾，故選擇470nm為測定波長。

圖1 磷脂紫外可見吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectrum of phospholipid

2.2 破壁條件的確定

根據(jù)表1可知，隨著乙醇用量的增加，吸光度逐漸增大，脂質(zhì)體破壁越來越嚴(yán)重；當(dāng)乙醇用量為0.8mL時(shí)，吸光度基本穩(wěn)定，繼續(xù)增大乙醇用量，對吸光度幾乎沒影響，說明乙醇用量為0.8mL時(shí)能充分打開脂質(zhì)體，從而釋放出所有磷脂。固定乙醇用量為0.8mL，考察破壁時(shí)間對吸光度的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)超聲時(shí)間為15min時(shí)，吸光度基本穩(wěn)定，且繼續(xù)延長破壁時(shí)間，吸光度變化不顯著（p＞0.05），證明此時(shí)樣品破壁完全（表2）。上述結(jié)果確定薏苡仁油脂質(zhì)體的最佳破壁條件為乙醇用量0.80mL，超聲時(shí)間15min。

表1 乙醇用量對吸光度的影響Table 1 The effect of ethanol volume on absorbance

表2 超聲時(shí)間對吸光度的影響Table 2 The effect of ultrasonic time on absorbance

2.3 離心條件的確定

2.3.1 離心速度[16]的確定 分別采用不同的離心速度3000、5000、10000、15000、20000r/min離心10min，然后精確取上層液適量，按照2.2破壁條件破壁，按照1.2.2的方法處理后于470nm波長處測定吸光度，考察離心速度對吸光度的影響。如圖2所示，隨著離心速度的升高，未包覆脂質(zhì)體測定的吸光度值逐漸降低，脂質(zhì)體分層逐漸明顯，

圖2 離心速度對吸光度的影響Fig.2 Effect of centrifuging speed on absorbance

由于包覆脂質(zhì)體的重量高于常規(guī)未包覆脂質(zhì)體，隨著離心速度的提高，越來越多的包覆脂質(zhì)體沉于下層，而未包覆脂質(zhì)體置上層，即未包覆脂質(zhì)體測定的吸光度值逐漸降低；當(dāng)離心速度為10000r/min離心時(shí)，樣品的吸光度達(dá)到最小值，包覆脂質(zhì)體能出現(xiàn)明顯的分層；之后隨著離心速度的升高吸光度逐漸升高，可能是由于離心速度過大，所被包覆的脂質(zhì)體從羧甲基殼聚糖層中溢出變成未包覆脂質(zhì)體所致。

圖3 離心時(shí)間對吸光度的影響Fig.3 The effect of centrifuging time on absorbance

2.3.2 離心時(shí)間的確定 按照確定10000r/min離心速度分別離心5、10、15、20、25min，然后精確取上層液適量，經(jīng)破壁，測定吸光度，考察離心時(shí)間對吸光度的影響，結(jié)果如圖3所示。

同樣離心時(shí)間不足時(shí)，吸光度偏大，由上層液中殘留包覆脂質(zhì)體所致；當(dāng)離心時(shí)間過長時(shí)，結(jié)果偏大，源于包覆脂質(zhì)體從包覆層中滲漏，綜上選取離心時(shí)間為15min。

2.4 包覆率的測定

將一系列濃度的薏苡仁油溶液在470nm處測定吸光度A后，以A對濃度C（mg/mL）進(jìn)行線性回歸（如圖4所示），得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=10.963C+0.0156，相關(guān)系數(shù)R2=0.9991，在0.01～0.1mg/mL的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。包覆率計(jì)算公式為：

式中：C1—包覆脂質(zhì)體離心后測得上清液中磷脂的濃度；C0—包覆脂質(zhì)體未經(jīng)離心直接測得磷脂的總濃度。

圖4 磷脂標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of phospholipid

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)測定的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，磷脂及脂質(zhì)體中平均回收率均高于99%，RSD＜2%，能滿足脂質(zhì)體中磷脂測定的要求[15]。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Result of recovery

2.6 精密度及重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

表4 精密度及重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Result of precision and reproducibility

精密度及重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示，磷脂溶液及脂質(zhì)體的測定結(jié)果的日內(nèi)、日間平均值均高于97%，RSD＜5%，說明該方法的精密度及重現(xiàn)性較好[16]。

3 結(jié)論

3.1 磷脂與硫氰酸銨產(chǎn)生的絡(luò)合物在470nm處有最大吸收，而薏苡仁油脂質(zhì)體、空白脂質(zhì)體和磷脂溶液峰形一致，薏苡仁油在470nm處吸收為負(fù)值，樣品中的薏苡仁油對磷脂含量測定基本無干擾，故選擇470nm為測定波長。磷脂標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=10.963C+0.0156，相關(guān)系數(shù)R2=0.9991，在0.01～0.1mg/mL的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

3.2 采用離心的方法將包覆脂質(zhì)體與未包覆脂質(zhì)體分離，并結(jié)合乙醇－超聲法破壁未包覆脂質(zhì)體，進(jìn)而計(jì)算磷脂含量及包覆率，經(jīng)回收率、精密度及重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證該方法的可行性。實(shí)驗(yàn)采用的離心分離速度為10000r/min，時(shí)間15min；破壁條件為超聲處理15min、乙醇用量0.8mL；該方法回收率高于99%，精密度及重現(xiàn)性高于97%。

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