驢血清膽堿酯酶抑制法快速檢測(cè)蔬菜中農(nóng)藥殘留

李穎暢，李作偉，呂艷芳，馬春穎

(渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧省高校重大科技平臺(tái)“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心”，遼寧錦州121013)

近年來(lái)由于食用含農(nóng)藥殘毒的蔬菜引起農(nóng)藥中毒的事件時(shí)有發(fā)生，尤其有機(jī)磷農(nóng)藥殘留較為常見(jiàn)。為了保障人們的健康和安全，各國(guó)都在加強(qiáng)對(duì)農(nóng)藥施用的管理及加強(qiáng)對(duì)農(nóng)藥殘留的監(jiān)測(cè)。氣相色譜、液相色譜等傳統(tǒng)儀器分析方法能有效檢測(cè)出蔬菜產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留含量，但檢測(cè)成本高、耗時(shí)長(zhǎng)［1－4］。為了防止因?yàn)E用農(nóng)藥引起的有機(jī)磷類農(nóng)藥的急性中毒，操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高的農(nóng)殘測(cè)定法的研究亟待確立。酶抑制法的原理是將蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品的樣品提取液和膽堿酯酶(cholinesterase，ChE)作用，然后在檢測(cè)體系加入底物和顯色劑，反應(yīng)一段時(shí)間后，在特征波長(zhǎng)測(cè)定吸光度的變化，計(jì)算膽堿酯酶的抑制率［5－6］，從而判斷農(nóng)藥殘留情況。ChE 廣泛存在于動(dòng)物的組織中，分為乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)和丁酰膽堿酯酶(bcetylcholinesterase，BChE)。目前對(duì)不同來(lái)源ChE的研究報(bào)道很多，該酶的實(shí)際應(yīng)用有賴于廉價(jià)豐富的材料和酶的活性［7－8］。目前有人用馬血清丁酰膽堿酯酶、魚腦中的乙酰膽堿酯酶、小麥中的植物酯酶檢測(cè)蔬菜中的有機(jī)磷農(nóng)藥，但存在膽堿酯酶提取手段繁瑣或材料不易得到等問(wèn)題［6，9－10］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究多種動(dòng)物組織的ChE，發(fā)現(xiàn)驢血清BChE廉價(jià)易得，酶活性較高，易分離純化，且對(duì)有機(jī)磷化合物反應(yīng)靈敏［9］。本文采用驢血清丁酰膽堿酯酶作為酶源，對(duì)不同的有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)條件和方法進(jìn)行了研究，同時(shí)通過(guò)酶抑制法對(duì)錦州地區(qū)的部分蔬菜進(jìn)行了農(nóng)藥殘留檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

隨機(jī)抽取錦州市區(qū)3個(gè)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)(以A、B、C表示)的蔬菜樣品，聚乙烯袋密封，2～4℃保存;新鮮驢血清 遼寧省朝陽(yáng)市北票動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所;碘化硫代丁酰膽堿、5，5＇－二硫代雙(2－硝基苯甲酸)(DTNB)Fluka公司;硫酸銨、牛血清蛋白(BSA)、考馬斯亮藍(lán)G－250、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;敵敵畏 湖北沙隆達(dá)股份有限公司;樂(lè)果 武漢鑫三角科技發(fā)展有限公司;敵百蟲 湖北省健源化工有限公司;高氯·馬拉硫磷 山東省聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)武漢化學(xué)試劑廠。

UV1600紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司;722型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;HH－501型超級(jí)恒溫水浴鍋、HH－6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司;玻璃儀器氣流烘干器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膽堿酯酶的提取 血清中膽堿酯酶的提取參照劉暢等［7］的方法。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法［12］?？捡R斯亮藍(lán)G－250在游離狀態(tài)下呈紅色，與蛋白質(zhì)結(jié)合后呈藍(lán)色。在一定濃度范圍內(nèi)，溶液在595nm波長(zhǎng)下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，可用比色法測(cè)定。牛血清蛋白濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=0.0004X+0.108(X:濃度，μg/mL;Y:吸光值)，R2=0.9993。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算驢血清中蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 丁酰膽堿酯酶(BChE)活力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)［7，13］的方法，略做修改。作為底物的碘化硫代丁酰膽堿被BChE分解為丁酸和硫代膽堿，硫代膽堿與DTNB反應(yīng)，生成一種黃色絡(luò)合物，在波長(zhǎng)410nm有吸收。以酶促反應(yīng)的初速度來(lái)確定酶活力。取3mL 0.2mol/L磷酸緩沖液(pH8.0)置于37℃水浴中，加入50μL酶提取液保溫 3min，然后依次加入 50μL 6.5mg/mL碘化硫代丁酰膽堿(BTChl)溶液，50μL 10mg/mL的DTNB溶液，充分混合，在波長(zhǎng)410nm進(jìn)行比色，記下吸光度的初始值，并記錄3min內(nèi)吸光度變化值。

式中，U:酶活力，μmol/(min·mg);V:反應(yīng)體系的總體積，mL;A:吸光度隨時(shí)間變化率，min－1;v:酶活測(cè)定時(shí)所取酶提取液的體積(μL);K:消光系數(shù)［L/(mmol·mm)］，1.36;C:蛋白質(zhì)濃度，mg/mL;L:比色皿光程，10mm。

1.2.4 有機(jī)磷農(nóng)藥濃度對(duì)抑制率的影響 將有機(jī)磷農(nóng)藥用去離子水配成不同濃度的溶液，取50μL酶液分別與不同濃度的有機(jī)磷農(nóng)藥在35℃保溫10min，然后依次加入底物、顯色劑DTNB，測(cè)其酶活力，以同時(shí)保溫的無(wú)農(nóng)藥的酶液為對(duì)照，計(jì)算BChE殘留的酶活力。以農(nóng)藥濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，BChE的抑制率為縱坐標(biāo)，繪制有機(jī)磷農(nóng)藥的抑制曲線。抑制率(I)的計(jì)算公式為:

式中，U0:未受抑制時(shí)BChE的活力;U1:受農(nóng)藥抑制時(shí)BChE的活力。

1.2.5 抑制時(shí)間對(duì)抑制率的影響 在抑制溫度為35℃，5mmol/L 底物 50μL，酶液 50μL，0.1mg/mL 的有機(jī)磷農(nóng)藥100μL條件下，考察抑制時(shí)間對(duì)抑制率的影響。抑制時(shí)間分別為 3、5、10、15、20、25min，測(cè)定每分鐘吸光度的變化值，計(jì)算抑制率。

1.2.6 檢測(cè)蔬菜中的農(nóng)藥殘留 取5.0g剪碎的蔬菜樣品，加入10mL 0.2mol/L pH8.0磷酸緩沖液及50μL 1%的溴水，振搖10min后，取2.5mL上清液，直接加入50μL丁酰膽堿酯酶(BChE)液，抑制20min，然后加入100μL顯色劑DTNB、50μL碘化硫代丁酰膽堿溶液，搖勻后立即移入比色試管，用紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)樣品至少做三個(gè)重復(fù)，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用ˉX±S表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)磷農(nóng)藥濃度對(duì)丁酰膽堿酯酶的抑制率的影響

據(jù)資料［7］報(bào)道，有機(jī)磷能與BChE的酯解部位的絲氨酸共價(jià)結(jié)合，形成磷?；憠A酯酶，此類復(fù)合體非常穩(wěn)定，膽堿酯酶酯鍵難以水解，不易使酶恢復(fù)原狀，從而降低酶促水解底物的能力。樂(lè)果、敵百蟲、敵敵畏、馬拉硫磷對(duì)驢血清 BChE的 IC50分別為0.094、0.179、0.124、0.0078mg/mL;在相同濃度下，驢血清BChE對(duì)其靈敏度的大小順序?yàn)?馬拉硫磷＞樂(lè)果＞敵敵畏＞敵百蟲。

常見(jiàn)農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如表1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)都在0.98以上，能滿足蔬菜中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求。

圖1 有機(jī)磷農(nóng)藥劑量與丁酰膽堿酯酶的抑制關(guān)系Fig.1 The inhibition relationship of organophosphorus pesticides dose and butyrylcholinesterase

2.2 抑制時(shí)間對(duì)丁酰膽堿酯酶抑制率的影響

從圖2可以看出，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，隨著抑制時(shí)間的延長(zhǎng)，丁酰膽堿酯酶抑制率顯著(p＜0.05)增加，樂(lè)果、敵敵畏抑制時(shí)間大于15min以后，對(duì)酶抑制率的影響趨于平穩(wěn)，抑制時(shí)間為15、20min，抑制率無(wú)顯著性差異(p＞0.05)，因此選擇抑制時(shí)間為15min。敵敵畏、馬拉硫磷對(duì)丁酰膽堿酯酶的抑制時(shí)間超過(guò)20min后，抑制率無(wú)顯著性(p＞0.05)提高，因此抑制時(shí)間為20min。

表1 常見(jiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥的曲線方程和相關(guān)系數(shù)Table 1 Common organophosphorus pesticides curve equation and the correlation coefficient

圖2 抑制時(shí)間對(duì)丁酰膽堿酯酶的抑制率的影響Fig.2 The effect of time on inhibition rate of butyrylcholinesterase

2.3 硫代磷酸鹽類農(nóng)藥的溴水氧化處理

硫代磷酸鹽類農(nóng)藥(如馬拉硫磷、樂(lè)果等)經(jīng)溴水氧化后，將此類農(nóng)藥中的P=S氧化成P=O，能提高對(duì)酶的抑制率［14］。如表2所示，硫代磷酸鹽類農(nóng)藥經(jīng)溴水氧化后，能明顯增大對(duì)膽堿酯酶的抑制率，即提高檢測(cè)的靈敏度。

表2 硫代磷酸鹽類農(nóng)藥用溴水處理前后酶抑制率的變化Table 2 The inhibition rate changes of the dithiophosphate pesticides with bromine water treatment

2.4 蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T5009.199－2003)［15］，當(dāng)被測(cè)樣品的抑制率小于50%時(shí)，結(jié)果為陰性，可判定樣品中無(wú)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留;當(dāng)被測(cè)樣品的抑制率大于50%時(shí)，結(jié)果為陽(yáng)性，認(rèn)為樣品中可能含有高劑量有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥。

用酶抑制法檢測(cè)3個(gè)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的部分蔬菜樣品，結(jié)果見(jiàn)表3，韭菜有2例檢測(cè)結(jié)果超標(biāo)，油菜有1例檢測(cè)結(jié)果超標(biāo)，尖椒有2例檢測(cè)結(jié)果超標(biāo);蔬菜樣品合格率為86.1%。如果樣品中含有對(duì)酶有抑制作用的活性物質(zhì)，可使BChE的抑制率偏高，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果;例如辣椒中的羥基或羰基上氫或氧可以破壞蛋白質(zhì)二硫鍵和氫鍵使蛋白質(zhì)變性，使乙酰膽堿酯酶失活［16］。如果樣品中含有較少的甲胺磷等農(nóng)藥殘留，BChE對(duì)該農(nóng)藥?kù)`敏度較低，會(huì)產(chǎn)生假陰性結(jié)果。通過(guò)與氣相色譜測(cè)定方法比較，符合率在85%以上。

表3 遼寧錦州地區(qū)蔬菜中農(nóng)藥殘留檢測(cè)結(jié)果(%)Table 3 The amount of pesticide residues in vegetables of Liaoning Jinzhou market(%)

3 結(jié)論

樂(lè)果、敵百蟲、敵敵畏、馬拉硫磷對(duì)驢血清BChE的 IC50分別為 0.094、0.179、0.124、0.0078mg/mL，驢血清BChE對(duì)這4種有機(jī)磷農(nóng)藥?kù)`敏度的大小順序?yàn)?馬拉硫磷＞樂(lè)果＞敵敵畏＞敵百蟲。樂(lè)果、敵敵畏對(duì)膽堿酯酶最佳抑制時(shí)間為15min;敵百蟲、馬拉硫磷最佳抑制時(shí)間為20min。用酶抑制法檢測(cè)3個(gè)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的蔬菜樣品，發(fā)現(xiàn)韭菜有2例檢測(cè)結(jié)果超標(biāo)，油菜有1例檢測(cè)結(jié)果超標(biāo)，尖椒有2例檢測(cè)結(jié)果超標(biāo);蔬菜樣品合格率為86.1%。

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