VC納米脂質(zhì)體懸浮液及其前體脂質(zhì)體的制備與穩(wěn)定性研究

鮑士寶，喻婷婷，馬福敏

(1.安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院，安徽鳳陽(yáng)233100;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)大連藥學(xué)院，遼寧大連116600)

VC是一種水溶性維生素，具有強(qiáng)還原性，被廣泛應(yīng)用于食品、藥品和化妝品中，保護(hù)其他有效成分不被氧化、抑制酶促褐變或脫色、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化等［1］。但VC對(duì)光、氧、pH以及溫度等環(huán)境條件非常敏感，易氧化變質(zhì)，因此其貯藏穩(wěn)定性是一個(gè)需要解決的問(wèn)題［2－4］。為了提高 VC的穩(wěn)定性和利用率，有關(guān)研究人員利用各種脂質(zhì)體自組裝技術(shù)制備了VC脂質(zhì)體，以期提高VC的穩(wěn)定性，但已有的研究報(bào)道中制備的VC脂質(zhì)體普遍存在著包封率不高、粒徑過(guò)大等問(wèn)題［5－8］。雖有新近報(bào)道表明，采用新的脂質(zhì)體基質(zhì)或多重包埋方法可以在一定程度上提高VC脂質(zhì)體的包封率和穩(wěn)定性，但增加了其平均粒徑［9－12］。目前制備脂質(zhì)體的方法主要有物理分散法、兩相分散法與表面活性劑增溶法三大類［13－15］;為了細(xì)化脂質(zhì)體的粒徑，常采用超聲、高壓均質(zhì)等后處理。乙醇注入法是屬于兩相分散法中的一種，該方法制備脂質(zhì)體具有操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、產(chǎn)品粒徑小、不使用無(wú)毒試劑等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素與正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化乙醇注入－高壓均質(zhì)法制備VC納米脂質(zhì)體懸浮液的工藝，得到包封率較高、粒徑在納米級(jí)別(＜100nm)的VC納米脂質(zhì)體懸浮液，并在此基礎(chǔ)上制備VC前體脂質(zhì)體，研究VC納米脂質(zhì)體懸浮液及其前體脂質(zhì)體的貯存穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋黃卵磷脂 純度為99%，購(gòu)于華東師范大學(xué)化工廠;VC、膽固醇、Tween80、甘油、無(wú)水乙醇、鹽酸、硫酸、硫脲、活性炭、2，4－二硝基苯肼、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、海藻糖 均為分析純，購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

RE－52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海青浦滬西儀器廠;SHB－Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;AH－100D型超高壓納米均質(zhì)機(jī) 加拿大ATS公司;755B型紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海分析儀器總廠;Nano－Zs90型粒徑分析儀 英國(guó)Malvern公司;DW－86L386型超低溫保存箱 青島海爾低溫技術(shù)有限公司;LGJ－10型冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 VC納米脂質(zhì)體懸浮液及其前體脂質(zhì)體的制備

1.2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn) 采用乙醇注入法制備VC納米脂質(zhì)體懸浮液，操作如下:

稱取一定質(zhì)量的VC和Tween80溶解于40mL、pH6.5、0.05mol/mL 的 Na2HPO4－KH2PO4緩沖液(PBS)中。另稱取400mg蛋黃卵磷脂和一定量的膽固醇溶解于8mL的無(wú)水乙醇中。用注射器將上述脂質(zhì)乙醇溶液快速注入溶有VC和Tween80的PBS中，控制水合溫度，水合一定時(shí)間，得到VC脂質(zhì)體懸浮液。將懸浮液移入150mL圓底燒瓶?jī)?nèi)，經(jīng)40℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)15min，揮去殘留乙醇。

選擇 VC添加量(80、120、160、200、240mg)、膽固醇與卵磷酯質(zhì)量比(1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2)、Tween80與卵磷脂質(zhì)量比(1∶5、2∶5、3∶5、4∶5、1∶1)、水合溫度(50、55、60、65、70℃)、水合時(shí)間(20、30、40、50、60min)為考察因素，研究各因素對(duì)懸浮液中VC脂質(zhì)體包封率的影響。

1.2.1.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 固定卵磷脂用量為400mg，水合時(shí)間為30min、乙醇用量為8mL、PBS用量為40mL，選取VC添加量(A)、膽固醇與卵磷脂質(zhì)量比(B)、Tween80與卵磷脂質(zhì)量比(C)、水合溫度(D)作為考察因素，以包封率為指標(biāo)，通過(guò)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化VC納米脂質(zhì)體懸浮液的制備工藝，因素水平表設(shè)計(jì)如下。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

用于性質(zhì)研究的VC納米脂質(zhì)體懸浮液為上述優(yōu)化后的最佳工藝制備所得，為了獲得粒徑較小的VC納米脂質(zhì)體懸浮液，采用100MPa高壓均質(zhì)循環(huán)處理3次。

1.2.1.3 VC前體脂質(zhì)體的制備 參照1.2.1.1中的操作，向PBS中添加1600mg海藻糖，按照1.2.1.2中的最佳工藝制備得到含海藻糖的VC納米脂質(zhì)體懸浮液。將此懸浮液裝于安培瓶中，－60℃預(yù)凍24h，后經(jīng)冷凍干燥(溫度－20℃;真空度＜20Pa)24h，得VC前體脂質(zhì)體。

1.2.2 包封率的測(cè)定

1.2.2.1 VC標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 以PBS作為溶劑，配制濃度分別為 0、8、16、32、48、64、80、96μg/mL 的 VC標(biāo)準(zhǔn)溶液。參照GB/T5009.86－2003中的2，4－二硝基苯肼法［16］，制作 VC標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖 1)，求得線性回歸方程為y=0.00341x+0.0168，R2=0.9998。由此可知在0～96μg/mL濃度范圍內(nèi)，VC溶液與吸光度線性關(guān)系良好。

圖1 VC標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of VC

1.2.2.2 包封率的測(cè)定 取VC脂質(zhì)體懸浮液5mL置于已處理過(guò)的透析袋中，封口，以200mL PBS作為透析外液，室溫下透析16h。取25mL透析外液，參照VC溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法，測(cè)定透析外液中VC的濃度C(μg/mL)。按式(1)計(jì)算包封率(EE):

式中:W0為VC添加量(mg);V為透析外液與內(nèi)液的總體積(mL)。

VC前體脂質(zhì)體經(jīng)PBS復(fù)水重建后按上述方法測(cè)定包封率。

1.2.3 粒徑的測(cè)定 取VC納米脂質(zhì)體懸浮液或VC前體脂質(zhì)體適量，以雙蒸水稀釋到適當(dāng)濃度，取適量置于粒徑分析儀的聚苯乙烯比色皿中(折光指數(shù)1.33)，25℃保溫3min，測(cè)定平均粒徑和多分散指數(shù)。

1.2.4 貯存穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取若干份新制備的VC納米脂質(zhì)體懸浮液(每份20mL)與前體脂質(zhì)體(每份800mg)，置于25mL的敞口試管內(nèi)，分別在4℃與25℃條件下貯存 30、60、90、120、150、180d，測(cè)定平均粒徑與滲漏率。按式(2)計(jì)算滲漏率(LR):

式中，EEt為t時(shí)刻的包封率;EE0為初始時(shí)刻的包封率。

2 結(jié)果與分析

2.1 VC納米脂質(zhì)體懸浮液的制備工藝優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1.1 VC添加量的影響 由圖2可知，在VC添加量較低的情況下，由于溶質(zhì)分子的濃度較低，增加了脂質(zhì)體在形成過(guò)程中對(duì)VC分子的“捕捉”難度，造成脂質(zhì)體對(duì)目標(biāo)物分子的包封率小。當(dāng)VC添加量為160mg時(shí)，VC脂質(zhì)體懸浮液的包封率最高，達(dá)到75.64%。但超過(guò)160mg的添加量，又導(dǎo)致VC的包封率降低，這是因?yàn)樵谝欢ǖ臈l件下，一定的磷脂用量形成的脂質(zhì)體數(shù)量是有限的，一定數(shù)量的脂質(zhì)體對(duì)于溶液中VC分子只表現(xiàn)有限的包封率，故當(dāng)VC添加量超過(guò)160mg并繼續(xù)增加時(shí)，包封率呈下降趨勢(shì)。因此，選擇VC添加量為160mg進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖2 VC添加量對(duì)包封率的影響Fig.2 Effect of the content of VCon encapsulation efficiency

2.1.1.2 膽固醇與卵磷脂質(zhì)量比的影響 由圖3的結(jié)果可以看出，當(dāng)膽固醇與卵磷脂的質(zhì)量比在1∶6～1∶4范圍內(nèi)時(shí)，得到的包封率較高，其中1∶5時(shí)達(dá)到包封率最大值。當(dāng)膽固醇用量繼續(xù)增加時(shí)(1∶5～1∶2)，包封率不斷降低，這是由于膽固醇的加入，會(huì)增強(qiáng)脂質(zhì)體雙分子層膜的剛性和致密度，提高了脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，防止VC的泄漏，確保了脂質(zhì)體對(duì)VC的有效包封。但是，當(dāng)膽固醇的加入比例超出一定范圍，脂質(zhì)體雙分子層膜中的膽固醇嵌入量過(guò)高時(shí)，會(huì)干擾雙分子層結(jié)構(gòu)的形成，導(dǎo)致VC分子從脂質(zhì)體中的泄漏［17］。因此，選擇膽固醇與卵磷脂質(zhì)量比為1∶5進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖3 膽固醇與卵磷脂質(zhì)量比對(duì)包封率的影響Fig.3 Effect of cholesterol to egg PC mass ratios on encapsulation efficiency

2.1.1.3 Tween80與卵磷脂質(zhì)量比的影響 圖4的結(jié)果表明，隨著Tween80添加比例的增加，包封率增大，當(dāng)Tween80的添加比例超過(guò)4∶5時(shí)，包封率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。Tween80的加入會(huì)使脂質(zhì)體表面產(chǎn)生“稠化效應(yīng)”［18］，增加脂質(zhì)體雙分子層的有效厚度，提高對(duì)VC的包封效果;但Tween80對(duì)脂質(zhì)體還存在著一定的增溶作用，過(guò)量的Tween80會(huì)造成脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的破壞，會(huì)導(dǎo)致VC的泄漏。所以Tween80的添加量要控制在一定的范圍內(nèi)，既能達(dá)到對(duì)懸浮液中脂質(zhì)體的空間穩(wěn)定效果，又要保證脂質(zhì)體雙分子層結(jié)構(gòu)的完整性。因此，選擇Tween80與卵磷脂質(zhì)量比為4∶5進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖4 Tween80與卵磷脂質(zhì)量比對(duì)包封率的影響Fig.4 Effect of Tween80 to egg PC mass ratios on encapsulation efficiency

2.1.1.4 水合溫度的影響 圖5為水合溫度對(duì)VC脂質(zhì)體懸浮液包封率的影響，結(jié)果顯示55℃時(shí)包封率最高，低于或高于55℃包封率都有所下降。在脂質(zhì)體的制備過(guò)程中，必須控制水合溫度高于磷脂的相變溫度，這樣才能使磷脂在PBS中分散均勻，有利于形成結(jié)構(gòu)良好的脂質(zhì)體，提高對(duì)芯材的包封率;而較高的水合溫度可能會(huì)使得卵磷脂發(fā)生部分氧化，影響脂質(zhì)體的形成與對(duì)芯材的包封率，同時(shí)過(guò)高溫度也會(huì)加速VC的氧化。因此，選擇水合溫度為55℃進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖5 水合溫度對(duì)包封率的影響Fig.5 Effect of hydration temperature on encapsulation efficiency

2.1.1.5 水合時(shí)間的影響 由圖6結(jié)果可知，在20～30min范圍內(nèi)，水合時(shí)間的變化對(duì)包封率的影響不明顯，水合30min得到的包封率最大，水合60min得到的包封率最小，但兩者相差僅為5.9%?？紤]水合時(shí)間越長(zhǎng)，可能造成的VC與卵磷脂氧化程度越大，因此水合時(shí)間不應(yīng)選擇過(guò)長(zhǎng)，故選擇30min進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖6 水合時(shí)間對(duì)包封率的影響Fig.6 Effect of hydration time on encapsulation efficiency

2.1.2 正交實(shí)驗(yàn) 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，可以看出:膽固醇與卵磷脂質(zhì)量比是影響包封率的最重要因素，其次是VC添加量、Tween80與卵磷脂質(zhì)量比，而水合溫度影響程度最小;最優(yōu)組合為A2B2C2D2。

由于A2B2C2D2組合沒(méi)有出現(xiàn)在所設(shè)計(jì)的正交實(shí)驗(yàn)中，因此將 A2B2C2D2組合與正交實(shí)驗(yàn)中的A2B2C3D1組合進(jìn)行三次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表 3中的結(jié)果可知，A2B2C2D2組合優(yōu)于A2B2C3D1組合。最終確定乙醇注入法制備VC脂質(zhì)體懸浮液的最佳工藝條件為:VC添加量為160mg，膽固醇與卵磷脂的質(zhì)量比為1∶5，Tween80與卵磷脂質(zhì)量比為4∶5，水合溫度為55℃。在該工藝條件下制備的VC脂質(zhì)體懸浮液的平均包封率為78.11%，高于童桂鴻、楊水平、陳婷婷以及趙華等人［5－8］分別采用薄膜分散法、逆相蒸發(fā)法、復(fù)乳法制備得到的VC脂質(zhì)體懸浮液的包封率。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of the orthogonal test

表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of verification experiments

2.2 VC納米脂質(zhì)體懸浮液及其前體脂質(zhì)體的貯存穩(wěn)定性

測(cè)得新制備的VC納米脂質(zhì)體懸浮液及其前體脂質(zhì)體的平均粒徑分別為89.62、121.14nm，多分散指數(shù)分別為0.160、0.195。結(jié)果表明，制備的VC納米脂質(zhì)體粒徑在納米級(jí)別(＜100nm)，且粒徑分布范圍較窄、分布均勻;與VC納米脂質(zhì)體懸浮液相比，前體脂質(zhì)的平均體粒徑和多分散指數(shù)有所增大，可能是干燥過(guò)程中部分脂質(zhì)體的相互融合所致。

圖7結(jié)果顯示，在4和25℃的貯存溫度下，VC納米脂質(zhì)體懸浮液及其前體脂質(zhì)體的平均粒徑與滲漏率都隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)而增大;但后者變化趨勢(shì)小于前者，這表明經(jīng)冷凍干燥后VC脂質(zhì)體的貯存穩(wěn)定性得到提高。另外，與4℃相比，在25℃的貯存溫度下，VC納米脂質(zhì)體懸浮液及其前體脂質(zhì)體的平均粒徑、滲漏率隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)增加趨勢(shì)要大得多，這說(shuō)明隨著貯存溫度的升高，兩種VC脂質(zhì)體體系的穩(wěn)定性都是下降的。

圖7 VC納米脂質(zhì)體懸浮液及其前體脂質(zhì)體的貯存穩(wěn)定性Fig.7 Stability of VCnanoliposomes suspension and VCproliposomes during storage period

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了乙醇注入法制備VC納米脂質(zhì)體懸浮液的工藝，得到最佳制備工藝為:卵磷脂用量400mg、乙醇用量8mL、PBS用量40mL，VC添加量160mg、膽固醇與卵磷脂的質(zhì)量比1∶5、Tween80 與卵磷脂質(zhì)量比 4∶5、水合溫度 55℃、水合時(shí)間30min，采用100MPa高壓均質(zhì)后處理，循環(huán)次數(shù)為3次，得到平均包封率為78.11%。按此最佳制備工藝得到的VC納米脂質(zhì)體懸浮液的平均粒徑為89.62nm，多分散指數(shù)為0.160;該懸浮液經(jīng)冷凍干燥后得到平均粒徑為121.14nm、多分散指數(shù)為0.195的VC前體脂質(zhì)體。貯存穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種VC脂質(zhì)體體系的穩(wěn)定性都受到貯存時(shí)間與貯存溫度的影響，但前體脂質(zhì)體的穩(wěn)定性高于VC納米脂質(zhì)體懸浮液。

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