鴨蛋腌制前后于低頻波段的阻抗特性研究

鄭應(yīng)家，王浩月，楊 哪，金亞美，王金鵬，徐學(xué)明，金征宇，*

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122;2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122;3.通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)(上海)有限公司，上海200233)

生物電學(xué)阻抗技術(shù)(Electrical Bio－impedance Measuring Technology)作為一種電化學(xué)技術(shù)，可對(duì)生物組織與器官的電學(xué)特征進(jìn)行檢測(cè)，不同的生物體組織由于內(nèi)外液體和鹽分含量以及不同蛋白組分的內(nèi)外電荷分布差異造成了阻抗特性的不同［1－3］。借助驅(qū)動(dòng)電極向檢測(cè)對(duì)象輸入微小的交變電信號(hào)，同時(shí)測(cè)量響應(yīng)信號(hào)并計(jì)算出阻抗，以便獲取相關(guān)生理學(xué)信息［4］。長(zhǎng)久以來(lái)，對(duì)生物組織電學(xué)阻抗特性的研究，一直是生理學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程的關(guān)注熱點(diǎn)，在農(nóng)產(chǎn)品領(lǐng)域則作為一種非損傷性檢測(cè)技術(shù)得到廣泛研究，其檢測(cè)原理包括生物組織的R－C等效電路模型、Cole－Cole理論和 Schwan的頻散理論。張愛(ài)萍［5］等研究了牛奶的總阻抗、雙電層電容、阻抗角等參數(shù)并發(fā)現(xiàn)以總阻抗作為檢測(cè)參數(shù)得到的菌落總數(shù)值符合實(shí)際情況;林榮生［6］通過(guò)電路模型分析發(fā)現(xiàn)生物活化的微珠、微叉指電極之間的電容、溶液的電阻對(duì)電化學(xué)阻抗傳感單元的輸出特性有顯著影響;胡珂文等［7］研究了1Hz～1MHz下牛奶中微生物阻抗的變化情況;丁強(qiáng)等［8］提出了阻抗技術(shù)在肉制品理化指標(biāo)檢測(cè)方面的應(yīng)用;馬青等［9］研究了家兔紅細(xì)胞的阻抗特性和等效電路并發(fā)現(xiàn)多個(gè)特性頻率。咸蛋是中華傳統(tǒng)美食，作為一個(gè)復(fù)雜的電介質(zhì)體系，鴨蛋在腌制前后其蛋清和蛋黃的含水量、出油率、鹽分等變化都影響其阻抗特性。目前未見(jiàn)詳盡的咸蛋電學(xué)阻抗特性研究數(shù)據(jù)發(fā)表，本文通過(guò)對(duì)鴨蛋腌制過(guò)程中阻抗特性的研究建立一個(gè)可行的評(píng)價(jià)方法，對(duì)于食品機(jī)械和分析檢測(cè)儀器的研究有參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鴨蛋 取無(wú)錫大潤(rùn)發(fā)超市鴨蛋70枚(60g左右);精密阻抗分析儀、阻抗測(cè)試治具 1011J Precision Impedance AnalyZer 65120B，Wayne Kerr，英國(guó)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鴨蛋腌制 將新鮮鴨蛋洗凈、標(biāo)記，水燒開(kāi)后配制濃度為20%的食鹽水，放置冷卻后，將配好的溶液與適量的草木灰混合調(diào)稀，裹在鴨蛋的表面約5mm厚，再裹上一層約3mm厚的干草木灰，裹好后用保鮮膜密封，18℃放置，每周測(cè)量其水分、鹽分、蛋黃出油率、蛋黃硬化率、蛋白質(zhì)種類(lèi)理化參數(shù)，腌制6周。

1.2.2 阻抗特性測(cè)試 采用精密阻抗分析儀和平行板(圓形)阻抗測(cè)試治具1J1011測(cè)量液體阻抗特性。取蛋清、蛋黃各1g，分別置于平行板阻抗治具中，測(cè)試直徑18mm、厚度1mm。由精密阻抗分析儀計(jì)算出物料的阻抗幅值和相位角。本阻抗分析儀可提供范圍(100Hz～12MHz)間200個(gè)頻率點(diǎn)下的阻抗特性值，取平均值，采用ZSimpWin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。測(cè)試前分別用空氣、標(biāo)準(zhǔn)電容和電阻對(duì)阻抗治具在所測(cè)頻率區(qū)間進(jìn)行開(kāi)路和短路校準(zhǔn)，然后運(yùn)行并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3 蛋品鹽分含量測(cè)定 以氯化鈉含量計(jì)，采用硝酸銀滴定法測(cè)定［10］。

1.2.4 蛋黃硬化率測(cè)定［11］用濾紙將咸蛋清和咸蛋黃分離，蛋黃稱(chēng)重記錄質(zhì)量W0，然后用小刀挖去蛋黃內(nèi)部軟的部分，剩下的硬蛋黃部分稱(chēng)重記錄質(zhì)量W1，蛋黃硬化率(%)=W1/W0×100。

1.2.5 蛋黃出油率測(cè)定［11］稱(chēng)取3g蛋黃在35mL的正己烷和異丙醇(3∶2，體積比)混合，均質(zhì)5000r/min下10min，然后濾液通過(guò)濾紙收集后，于55℃蒸發(fā)掉溶劑，105℃干燥恒重，殘?jiān)|(zhì)量W0作為總的脂肪含量。浸出油量測(cè)定是采用5g咸蛋黃與25mL去離子水混合在5000r/min下均質(zhì)30s，勻漿在25℃ 9000r/min下處理40min，然后在上清液添加25mL的正己烷和異丙醇(3∶2體積比)溶解掉懸浮體。有機(jī)溶劑－脂相層通過(guò)分液漏斗獲取，于55℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，剩下的105℃干燥恒重，殘余質(zhì)量W1作為浸出游離油脂。

1.2.6 SDS－PAGE凝膠電泳對(duì)蛋黃和蛋清蛋白質(zhì)種類(lèi)測(cè)定［12］制備12%的分離膠和5mL的濃縮膠，取咸蛋清和咸蛋黃各0.0008g于1mL離心管中，加樣品處理液80μL，加熱5min，振蕩混合，確保溶解，在轉(zhuǎn)速5000r/min下離心10min。樣品處理好后加樣，在15mA條件下跑膠。結(jié)束后將膠體置于去離子水中保存，用凝膠電泳成像儀拍出清晰度和大小合適的照片并保存。

2 結(jié)果與討論

2.1 鴨蛋腌制前后蛋清與蛋黃的等效電路模型構(gòu)建

凝膠電泳圖中蛋白質(zhì)條帶位于不同的位置與蛋白質(zhì)本身的分子量和所帶電荷量有關(guān)，由此原理在構(gòu)建電路模型時(shí)，以不同條帶區(qū)域的蛋白質(zhì)代表一種單元電路進(jìn)行模擬。從圖1可知，腌制前后鴨蛋蛋白質(zhì)種類(lèi)變化不大，這一結(jié)論和Thammarat的研究相同［11］。蛋清蛋白質(zhì)主要有45ku區(qū)間的卵白蛋白、36ku區(qū)間的卵清蛋白和18ku區(qū)間的卵類(lèi)粘蛋白，而卵類(lèi)粘蛋白屬于混合物，含溶酶菌、卵蛋白酶抑制物、卵糖蛋白等［11］。因不同蛋白質(zhì)界面形態(tài)和所帶凈電荷的差異，蛋白質(zhì)不是理想的電阻或電容，本文假定蛋白質(zhì)作為一個(gè)純電阻R和常相位角元件Q的串聯(lián)電路，常相位角元件指數(shù)n=1時(shí)，可表示為純電容，n=0則常相位角元件表示純電阻［13］，其中0＜n＜1。蛋清和蛋黃屬于不同分子量蛋白質(zhì)的分散體系，相互成團(tuán)聚集［14］，本文構(gòu)建等效電路時(shí)將每個(gè)蛋白質(zhì)單元電路的常相位角元件Q部分與另一個(gè)蛋白質(zhì)單元電路的并聯(lián)看待，鮮蛋清和咸蛋清等效電路模型都可以看成蛋清常相位元件QW、蛋清電阻RW、卵白蛋白電阻RO、卵白蛋白常相位元件QO、卵清蛋白電阻RC、卵清蛋白常相位元件QC、卵類(lèi)粘蛋白電容COV、卵類(lèi)粘蛋白電阻ROV和蛋白質(zhì)漏電阻RWM組成，等效電路圖和電路碼如圖2。蛋黃作為一個(gè)復(fù)雜的生物體系而含有不同分子量的脂蛋白且腌制前后蛋白質(zhì)種類(lèi)無(wú)差異，造成條帶位置差異可能由于脂蛋白的脫水作用造成［11］，故將鮮蛋黃和咸蛋黃作為一種等效電路模型研究。同理對(duì)此電路網(wǎng)絡(luò)可以把相近分子量36ku區(qū)間的卵黃高磷蛋白為常相位角元件QP和其電阻RP，43ku區(qū)間的高密度脂蛋白可作為QH和RH，66～100ku區(qū)間的低密度脂蛋白作為CL和R［11］L，而蛋黃整體可以看為一個(gè)蛋黃體電容QY，蛋黃體電阻RY的串聯(lián)，所有蛋白質(zhì)漏電阻為RYM，則電路圖和電路碼如圖3所示，擬合參數(shù)如表1所示。

圖1 鴨蛋腌制前后蛋清和蛋黃凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of duck egg white and yolk before and after salting

2.2 鴨蛋腌制前后蛋清和蛋黃阻抗特性研究

從蛋清和蛋黃的Bode圖(圖4)、復(fù)導(dǎo)納圖(圖5)和R/I圖(圖6)可看出構(gòu)建的等效電路和蛋清蛋黃實(shí)際阻抗特性曲線(xiàn)的擬合情況，其中Chi squared越小越好，圖示中MSD為樣品實(shí)際測(cè)量值，Calc為等效電路擬合值。圖4為蛋清和蛋黃在腌制前后的相頻和幅頻曲線(xiàn)即為Bode圖，可以看出蛋清和蛋黃的阻抗幅值都隨頻率的提高而降低，而咸蛋清和咸蛋黃的阻抗值整體低于鮮蛋清和咸蛋黃的阻抗值，這是因?yàn)橄痰扒搴拖痰包S的NaCl離子含量高，導(dǎo)電性增加。由相位角特性可以看出在激勵(lì)信號(hào)下，通過(guò)體系的電壓信號(hào)落后于電流信號(hào)的時(shí)間［15－16］。鮮蛋清的相位角轉(zhuǎn)折頻率為2.859kHz，咸蛋清的相位角轉(zhuǎn)折頻率為426Hz，蛋清的相位轉(zhuǎn)折頻率都在低頻區(qū)域可能為α散射，通常發(fā)生在音頻區(qū)域(幾Hz到十幾千Hz)，反映體系細(xì)胞蛋白質(zhì)界面離子層引起的介電弛豫現(xiàn)象［17］，此段頻率電場(chǎng)下的蛋清和蛋黃具有較高絕緣性和較低導(dǎo)通性，即低頻段反映細(xì)胞蛋白質(zhì)外部的電學(xué)信息。鮮蛋黃的相位轉(zhuǎn)折頻率為3.603、102.2、2.859、5.273MHz，而咸蛋黃則無(wú)相位轉(zhuǎn)折頻率，可能是鹽分導(dǎo)致蛋黃脫水，脂蛋白中的油脂和載脂蛋白分離造成的電學(xué)特性差異。其中5.273MHz可能為鮮蛋黃的β散射頻率，位于幾十千Hz到幾十萬(wàn)Hz區(qū)間，反映了細(xì)胞蛋白質(zhì)界面和其內(nèi)部的容抗特性隨電場(chǎng)頻率的變化規(guī)律，即細(xì)胞蛋白質(zhì)作為電容的充、放電介電弛豫過(guò)程，具有低絕緣性和高導(dǎo)通性，體現(xiàn)細(xì)胞蛋白內(nèi)部對(duì)電場(chǎng)的響應(yīng)特性［18］

表1 腌制前后蛋清和蛋黃等效電路擬合參數(shù)Table 1 Equivalent circuit fitting parameters of duck egg white and yolk before and after salting

圖2 腌制前后蛋清的等效電路模型與電路碼Fig.2 Equivalent circuit model and circute discription code of duck egg white before and after salting

圖3 腌制前后蛋黃的等效電路模型與電路碼Fig.3 Equivalent circuit model and circute discription code of duck egg yolk before and after salting

圖4 腌制前后蛋清和蛋黃的Bode圖Fig.4 Bode plot of duck egg white and yolk before and after salting

圖5為蛋清和蛋黃的復(fù)導(dǎo)納圖，代表阻抗實(shí)部和虛部倒數(shù)在不同頻率下的特性半圓曲線(xiàn)，可以看出各自的特征頻率的變化，鮮蛋清為137.7kHz;咸蛋清為 13.43kHz;鮮蛋黃為 265.9kHz;咸蛋黃為1.776kHz，可知蛋清和蛋黃腌制后的特征頻率都向音頻范圍移動(dòng)。

圖5 腌制前后蛋清和蛋黃的復(fù)導(dǎo)納圖Fig.5 Complex admittance plot of duck egg white and yolk before and after salting

由圖6可知，鮮蛋清和咸蛋清阻抗虛部絕對(duì)值與實(shí)部隨頻率升高呈現(xiàn)單調(diào)遞減趨勢(shì)，鮮蛋清的阻抗實(shí)部和虛部絕對(duì)值相近，但咸蛋清的虛部絕對(duì)值大于實(shí)部，虛部為電抗代表材料對(duì)交流電的阻礙作用，咸蛋清對(duì)交流電信號(hào)的阻礙作用弱于鮮蛋清。蛋黃的阻抗各部都隨頻率升高而整體趨于遞減，阻抗虛部絕對(duì)值低于實(shí)部，鮮蛋黃阻抗虛部有處轉(zhuǎn)折峰f=44.3kHz，這一特征與蛋清相反，這也可能與鹽分含量和脂蛋白分離有關(guān)，此轉(zhuǎn)折頻率在之前的Bode圖和復(fù)導(dǎo)納圖中未出現(xiàn)，原因有待進(jìn)一步分析。

2.3 鴨蛋腌制前后蛋清和蛋黃阻抗特性與理化指標(biāo)相關(guān)性

圖6 腌制前后蛋清和蛋黃的R/I圖Fig.6 R/I plot of duck egg white and yolk before and after salting

將表2和表3中各頻率下的阻抗值和相位角與各理化指標(biāo)進(jìn)行回歸分析發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)激勵(lì)信號(hào)為102Hz時(shí)，阻抗值與蛋清和蛋黃的部分理化指標(biāo)的回歸方程較顯著，其中X－阻抗幅值，Ω:

蛋清鹽分和阻抗值的二項(xiàng)式回歸擬合方程為:y=－0.0076X2+0.4421X+7.933，R2=0.9412;

蛋黃鹽分和阻抗值的三項(xiàng)式回歸擬合方程為:y=－4e－6X3+0.0013X2－0.147X+6.3242，R2=0.9515;

蛋黃硬化率和阻抗值的線(xiàn)性回歸擬合方程為:y=－0.2428X+97.214，R2=0.9574;

蛋黃出油率和阻抗值的二項(xiàng)式回歸擬合方程為:y=0.0035X2－0.7424X+53.264，R2=0.9524;

由此可知，低頻區(qū)域的各頻率點(diǎn)下其阻抗值對(duì)鴨蛋腌制過(guò)程中的鹽分含量、出油率和硬化率都具有較顯著的預(yù)測(cè)效果，而隨頻率的升高則在單個(gè)頻率點(diǎn)下的不同腌制時(shí)間蛋清和蛋黃的阻抗值與相位角并無(wú)規(guī)律性變化，這一特點(diǎn)對(duì)研制咸蛋品理化指標(biāo)的檢測(cè)具有參考價(jià)值。同樣張軍等［19］通過(guò)采用混合式電極在激勵(lì)頻率591Hz下發(fā)現(xiàn)魚(yú)體阻抗特性與化學(xué)指標(biāo)TVBN有良好的回歸顯著特性，從而可預(yù)測(cè)魚(yú)肉的新鮮度。

表2 不同激勵(lì)頻率下咸鴨蛋在腌制過(guò)程中的阻抗幅值和相位角Table 2 Impedance amplitude and phase angle changes of salted duck egg at different frequency in the process of salting

表3 咸鴨蛋于18℃腌制過(guò)程中的理化指標(biāo)Table 3 Physical and chemical indexes of salted duck egg in the process of salting at 18℃

3 結(jié)論

采用生物阻抗技術(shù)對(duì)鴨蛋腌制期間的阻抗特性變化進(jìn)行了研究，通過(guò)凝膠電泳對(duì)腌制前后蛋清和蛋黃的蛋白質(zhì)定性并建立了等效電路;研究了腌制期間蛋清和蛋黃100Hz～12MHz頻域的Bode圖、復(fù)導(dǎo)納圖、實(shí)部虛部圖確定了特征頻率和各自可能的散射類(lèi)型;在低頻102Hz下蛋清和蛋黃在腌制過(guò)程中的鹽分含量、出油率和硬化率都與阻抗幅值有較顯著的回歸特性。在前期研究中，通過(guò)對(duì)腌制的雞蛋、紅心鴨蛋(飼料蛋)、普通農(nóng)家鴨蛋的阻抗特性研究，發(fā)現(xiàn)各自的阻抗譜圖形幾乎無(wú)任何差異，故還無(wú)法進(jìn)行該類(lèi)的定性辨別。這是因?yàn)榈捌防锩娴母黝?lèi)脂蛋白和蛋清蛋白種類(lèi)與分子量相差不大，而阻抗特性只能反映材料的電學(xué)性質(zhì)和一些宏觀(guān)理化參數(shù)變化，所以對(duì)成分中不同分子含量和種類(lèi)差異這樣的微觀(guān)性質(zhì)還無(wú)法進(jìn)行揭示。

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