青霉α-半乳糖苷酶基因工程菌表達(dá)條件優(yōu)化

北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所 張 波 蕭培珍 張寶彤＊

α-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.22）主要催化半乳糖類寡糖和多聚半乳-（葡）苷露聚糖非還原性末端α-1，6鍵結(jié)合的半乳糖苷化合物水解，因此其能水解棉子糖、水蘇糖和毛蕊糖等低聚糖。自然界微生物分泌表達(dá)α-半乳糖苷酶活性很低，生產(chǎn)成本較高，難以適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的要求。為提高青霉α-半乳糖苷酶（α-Gal）的活力，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了青霉α-半乳糖苷酶基因工程菌pPIC9k-9菌株。影響外源蛋白表達(dá)的因素較多，其中培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵液pH、誘導(dǎo)物的濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、種子接種量以及誘導(dǎo)濕菌重等均會(huì)影響外源蛋白的表達(dá)。本試驗(yàn)研究了基因工程菌高效表達(dá)的影響因素，為下一步的研究和生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)儀器 恒溫圓周搖床 （IKA KS4000i型，上海人和科學(xué)儀器有限公司）；雙光束紫外可見分光光度計(jì)（TU-1901型，北京普析通用儀器有限公司）。

1.1.2 試驗(yàn)菌株和培養(yǎng)基 青霉α-半乳糖苷酶重組菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存。

低鹽LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，水溶解后，用NaOH調(diào)pH至7.0，加水定容至1 L。高壓蒸汽滅菌20 min，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

緩沖型甘油復(fù)合培養(yǎng)基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，100 mmol/L磷酸鉀溶液 （pH 6.0），1.34%酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基，1%甘油，4×10-5%生物素。

緩沖型甲醇復(fù)合培養(yǎng)基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，100 mmol/L磷酸鉀溶液 （pH 6.0），1.34%酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基，0.5%甲醇，4×10-5%生物素。

1.1.3 主要試劑 酵母提取物、酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基及胰蛋白胨均購自O(shè)XOID公司，pNPG購自Sigma公司，其他試劑均購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用無菌牙簽挑取適量菌種接種于滅菌的LB液態(tài)培養(yǎng)基，28℃搖床培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至OD600為3.0時(shí)，收集菌體轉(zhuǎn)移至裝載30 mL緩沖型甘油復(fù)合培養(yǎng)基的100 mL三角瓶，28℃搖床培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至OD600為3.0時(shí)，收集菌體轉(zhuǎn)移至裝載150 mL緩沖型甲醇復(fù)合培養(yǎng)基的1 L三角瓶中，測(cè)定細(xì)胞OD600為3時(shí)，用一定濃度的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)72 h取發(fā)酵液于12000 r/min離心，取上清液測(cè)定其酶活性。

1.2.2 發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化 搖瓶水平發(fā)酵條件的優(yōu)化采用4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)，共9個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 因素與水平

1.2.3 酶活的測(cè)定 酶活的測(cè)定方法參考Rezessy-Szabó等（2007）的方法。 底物配制：用0.05 mol/L的乙酸鈉（pH 5.2）充分溶解對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷 （pNPG）至終濃度為10 mmol/L。

反應(yīng)過程：0.5 mL底物和0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液（用pH 5.2，0.05 mol/L的乙酸鈉稀釋）分別在40℃水浴保溫3 min，然后充分混和均勻，于40℃水浴反應(yīng)10 min，加入4 mL的0.5 mol/L的乙酸鈉終止反應(yīng)。產(chǎn)生的黃色對(duì)硝基酚于405 nm處進(jìn)行吸光度測(cè)定。

酶活單位定義：在40℃、pH 5.2的條件下，每分鐘從濃度為10 mmol/L的pNPG溶液中降解釋放1 μmol的對(duì)硝基酚所需要的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。

2 結(jié)果與討論

基因工程產(chǎn)品通過表達(dá)優(yōu)化，可以為發(fā)酵生產(chǎn)提供良好的工藝條件，降低成本，提高經(jīng)濟(jì)效益，提高產(chǎn)品的競(jìng)爭(zhēng)力（顧娟等，2010）。pH可影響底物分子和酶分子的帶電狀況，從而影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用和酶的活力，這可能是發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH影響酵母細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的原因。種子接種量也是影響蛋白表達(dá)的一個(gè)因素，接種量的多少直接影響細(xì)胞生長(zhǎng)的速度，因此對(duì)于表達(dá)蛋白有直接或間接的影響。轉(zhuǎn)速對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響可能是由于酵母細(xì)胞屬于需氧微生物，搖床轉(zhuǎn)速直接影響發(fā)酵培養(yǎng)基中溶解氧的水平（Petzelbauer等，1999）。本試驗(yàn)將重組菌株pPIC9k-9在1 L搖瓶培養(yǎng)，誘導(dǎo)72 h，取其上清液測(cè)定相應(yīng)的酶活，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可見，培養(yǎng)基pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響最大，其次是搖床轉(zhuǎn)速，主次因素排列順序?yàn)椋号囵B(yǎng)基pH ＞搖床轉(zhuǎn)速＞種子接種量＞甲醇濃度。當(dāng)培養(yǎng)基pH為5，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，種子接種量為5%，甲醇濃度為1.0%時(shí)，發(fā)酵上清液酶活性最高。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)

本試驗(yàn)結(jié)果表明，容量為1 L的三角瓶裝載150 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)基pH對(duì)基因工程菌分泌青霉α-半乳糖苷酶酶活影響最大，其次是搖床轉(zhuǎn)速，主次因素排列順序?yàn)榕囵B(yǎng)基pH＞搖床轉(zhuǎn)速＞種子接種量＞甲醇濃度。

[1]顧娟，勞勛，金飛明，等.人胰高血糖素樣肽-1突變體融合蛋白在大腸桿菌中的自誘導(dǎo)表達(dá)純化[J].微生物學(xué)通報(bào)，2010，37（5）：726 ～ 731.

[2]Petzelbauer I，Nidetzky B，Haltrich D，et al.Development of an ultrahigh-temperature process for the enzymatic hydrolysis of lactose I.The properties of two thermostable β-glycosidases[J].Biotechnol Bioeng，1999，64（3）：322～332.

[3]Rezessy-Szabó J M，Nguyen Q D，HoschkeAˊ，et al.A novel thermostable α-galactosidase from the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus CBS 395.62/b：Purification and characterization[J].Biochim Biophys Acta，2007，1770：55～62.