幾種納米材料對(duì)斑馬魚孵化和致畸效應(yīng)的影響

尤 宏，呂麗娜，趙雪松，王樹濤

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，150090哈爾濱)

納米材料因其納米尺度和納米結(jié)構(gòu)而具有優(yōu)越的磁性、導(dǎo)電性、反應(yīng)活性、光學(xué)性質(zhì)而廣泛應(yīng)用于各種商業(yè)產(chǎn)品如電子器件、體育器材、防曬霜及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中［1］.納米材料在生產(chǎn)及使用過程中能通過各種途徑進(jìn)入環(huán)境.研究表明，涂料中的納米TiO2經(jīng)雨水沖刷可進(jìn)入水體［2］，同時(shí)納米顆?？稍趶U電池回收過程中被釋放［3］.納米材料在環(huán)境中經(jīng)水、土壤、大氣間的相互轉(zhuǎn)化后最終可能在水生生物體內(nèi)蓄積，通過飲食、呼吸、皮膚接觸，危害人類及生物的健康.納米顆?？梢鹕锏陌l(fā)育毒性［4-5］、氧化應(yīng)激［6］、生殖毒性［7］與呼吸毒性［8］.納米ZnO能破壞抗氧化防御系統(tǒng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的活性氧，引起機(jī)體氧化應(yīng)激損傷［9］.碳納米管水溶液可對(duì)彩虹鱒魚呼吸系統(tǒng)產(chǎn)生毒性，加快呼吸速率，1～2周持續(xù)暴露后引起心血管系統(tǒng)缺陷，最終導(dǎo)致死亡［8］.目前對(duì)發(fā)育毒性的研究相對(duì)有限，Bai等［10］研究表明納米ZnO在暴露質(zhì)量濃度為1～25 mg/L時(shí)，可延遲胚胎孵化，減少幼魚體長(zhǎng)，暴露96 h后引起尾部畸形.

斑馬魚作為模式生物具有生物個(gè)體小、易存活、胚胎透明、對(duì)水質(zhì)污染與毒性物質(zhì)反應(yīng)靈敏等優(yōu)點(diǎn)［11］.鑒于孵化率及畸形率是生長(zhǎng)發(fā)育的重要指標(biāo)，同時(shí)，納米材料對(duì)這兩個(gè)重要指標(biāo)的考察目前沒有得到系統(tǒng)性結(jié)論，且毒性作用機(jī)制尚不明確，選用斑馬魚胚胎為受試生物，研究環(huán)境中廣泛存在的典型納米材料——納米ZnO、納米TiO2以及碳納米管急性暴露對(duì)斑馬魚胚胎孵化率和畸形率的影響，為評(píng)判納米材料對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為系統(tǒng)地評(píng)價(jià)典型納米材料對(duì)環(huán)境生物及人體的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

納米ZnO(粒徑＜100 nm)、納米TiO2(粒徑20～40 nm)均購(gòu)自Sigma公司，碳納米管分散液(粒徑20～40 nm)購(gòu)自深圳市納米港有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

斑馬魚購(gòu)自武漢水生所，選當(dāng)年生成年斑馬魚，平均體長(zhǎng)3～4 cm，平均體質(zhì)量0.30 g.在本實(shí)驗(yàn)室(28±1)℃條件下，于循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中馴養(yǎng)20 d以上，選擇體形正常、魚鱗和鰭無破損、游動(dòng)靈活、捕食敏捷的成熟親魚進(jìn)行交配，以便收集魚卵.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

每種納米材料均設(shè)5個(gè)不同質(zhì)量濃度，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，每個(gè)質(zhì)量濃度均設(shè)3個(gè)平行.納米ZnO用營(yíng)養(yǎng)液(64.75 mg/L NaHCO3，5.75 mg/L KCl，123.25 mg/L MgSO4·7H2O和294 mg/L CaCl2·2H2O)配置成質(zhì)量濃度為1，5，10，20，50，100 mg/L染毒溶液，碳納米管和納米TiO2也分別用營(yíng)養(yǎng)液稀釋成10，20，40，60，100 mg/L暴露質(zhì)量濃度.

為了考察Zn2+溶出的影響，根據(jù)測(cè)定的不同質(zhì)量濃度下納米ZnO中融出的Zn2+質(zhì)量濃度，配置孵化液，進(jìn)行了Zn2+的對(duì)照實(shí)驗(yàn).

在體式解剖鏡下挑選發(fā)育正常的受精卵進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，選用直徑為12 cm的結(jié)晶皿作為實(shí)驗(yàn)器具，每個(gè)結(jié)晶皿中放200 mL的納米材料暴露液，100顆發(fā)育正常的受精卵，在受精卵產(chǎn)出后2.5～3.0 h(囊胚期初期)進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)，將結(jié)晶皿放在28℃的恒溫水浴鍋中培養(yǎng).暴露實(shí)驗(yàn)每24 h更換1次染毒溶液，以保證實(shí)驗(yàn)水中溶解氧和實(shí)驗(yàn)前后溶液質(zhì)量濃度相對(duì)穩(wěn)定.統(tǒng)計(jì)并記錄暴露后36、48、60、72、96 h等時(shí)段斑馬魚胚胎孵化情況，未孵化的魚卵用虹吸管吸出.因納米材料極易團(tuán)聚，每次更換溶液前對(duì)納米材料超聲30 min.

1.3 分析與表征

采用掃描電子顯微鏡SEM(MX2600FE，英國(guó)Camscan公司)和透射電子顯微鏡TEM(JEM-2100，日本電子公司)對(duì)納米材料進(jìn)行表征.

采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀ICP-MS(X7，美國(guó)Thermo公司)測(cè)定ZnO溶出的Zn2+質(zhì)量濃度.將配置好的納米ZnO染毒溶液靜止24 h，100 000轉(zhuǎn)離心30 min后取上清液，用ICP-MS測(cè)定得出1，5，10，20，50，100 mg/L納米ZnO溶出的Zn2+質(zhì)量濃度分別為0.59，2.25，1.51，3.96，3.1和2.37 mg/L.

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)做3次.采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用卡方檢驗(yàn)和t-檢驗(yàn)判斷實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組是否存在差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果和討論

2.1 納米材料的表征

采用SEM表征納米材料的表觀形貌，結(jié)果如圖1所示.可以看出:納米ZnO呈多邊形、不規(guī)則形狀;納米TiO2呈長(zhǎng)條立體狀;碳納米管呈明亮條狀，且相互交織.TEM表征得出材料粒徑均在納米尺度范圍內(nèi)，與廠商提供粒徑基本一致.

2.2 納米ZnO和Zn2+對(duì)斑馬魚胚胎孵化率影響

納米ZnO和Zn2+對(duì)斑馬魚胚胎96 h孵化率的影響如圖2所示.1，5，10，20，50，100 mg/L納米ZnO暴露組對(duì)應(yīng)的孵化率分別為88%，75%，56%，53%，46%，25%，隨著暴露質(zhì)量濃度的增加，孵化率下降顯著，且與暴露質(zhì)量濃度呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系.為考察納米ZnO溶出的Zn2+對(duì)孵化率是否有影響，根據(jù)1.3 ICP-MS測(cè)定的結(jié)果，設(shè)置系列Zn2+溶液的暴露組(0.59，2.25，1.51，3.96，3.1，2.37 mg/L)，得出Zn2+暴露對(duì)應(yīng)的孵化率分別為92%，89%，82%，79%，73%，75%.表明斑馬魚胚胎的孵化率雖然隨著Zn2+暴露質(zhì)量濃度的增加而有所下降，但較對(duì)照組變化不顯著，且同等暴露質(zhì)量濃度下，納米ZnO暴露組孵化率明顯低于Zn2+暴露組孵化率.由此可推斷，納米ZnO對(duì)胚胎孵化率有抑制作用，雖然Zn2+有溶出，但對(duì)孵化率沒有顯著影響.

圖1 納米材料的電鏡表征圖

圖2 納米ZnO和Zn2+對(duì)斑馬魚胚胎96 h孵化率的影響

圖3、4闡明了斑馬魚胚胎在36～96 h的累積孵化率.由圖3可見，斑馬魚胚胎48 h開始孵化，96 h全部孵出，在52～72 h(10～100 mg/L)暴露組，斑馬魚胚胎孵化速度顯著變慢，有孵化延遲的現(xiàn)象.由圖4可見，暴露質(zhì)量濃度增加后，Zn2+暴露組胚胎孵化率同樣有下降趨勢(shì).圖3、4表明，在相同暴露質(zhì)量濃度下，納米ZnO的累積孵化率顯著低于Zn2+，更直接地證明了Zn2+雖與納米ZnO的孵化抑制效應(yīng)有關(guān)，但是不起主要作用.納米ZnO導(dǎo)致斑馬魚胚胎孵化抑制可能是胚胎暴露在納米ZnO中后，納米級(jí)的ZnO會(huì)進(jìn)入胚胎的絨毛囊，從而將絨毛囊堵塞，導(dǎo)致胚胎不能正常分泌孵化酶和誘發(fā)組織缺氧所致.

圖3 納米ZnO對(duì)斑馬魚胚胎累積孵化率的影響

圖4 Zn2+對(duì)斑馬魚胚胎累積孵化率的影響

納米ZnO暴露組的斑馬魚胚胎出現(xiàn)心包水腫及卵黃囊水腫的畸形現(xiàn)象(圖5)，水腫是斑馬魚胚胎心血管系統(tǒng)缺陷所致.由圖6可以看出，隨著暴露質(zhì)量濃度的增加，水腫出現(xiàn)的幾率增大，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性.50及100 mg/L納米ZnO暴露，斑馬魚幼魚水腫率為5%及6.5%，且7%左右的水腫胚胎4～7 d后死亡，表明心血管系統(tǒng)也是納米ZnO毒物作用的主要靶器官.

圖5 斑馬魚胚胎水腫圖片

圖6 納米ZnO對(duì)斑馬魚胚胎水腫率的影響

2.3 碳納米管對(duì)斑馬魚孵化率的影響

碳納米管對(duì)斑馬魚孵化的存活率影響很小.如圖7所示，斑馬魚胚胎暴露于不同質(zhì)量濃度碳納米管溶液中96 h后基本全部孵出，未發(fā)現(xiàn)死亡或畸形等現(xiàn)象.由斑馬魚胚胎的累積孵化率(圖8)可以看出，在40，60，100 mg/L等高質(zhì)量濃度暴露組，斑馬魚孵化率與對(duì)照組相比顯著延遲，且隨著暴露質(zhì)量濃度的增加，孵化延遲效應(yīng)顯著加強(qiáng)，存在劑量依賴效應(yīng)，孵化延遲現(xiàn)象基本出現(xiàn)在52～76 h.

圖7 碳納米管對(duì)斑馬魚胚胎96 h孵化率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，導(dǎo)致斑馬魚胚胎延遲孵化的主要原因是碳納米管成團(tuán)聚集并吸附在卵膜外層，改變卵殼彈性并妨礙氧向胚胎組織內(nèi)傳輸，使組織處于缺氧狀態(tài)，最終導(dǎo)致胚胎孵化延遲.目前對(duì)于碳納米材料延遲胚胎孵化的機(jī)理還不清楚，有待進(jìn)一步研究.

圖836 ～96 h內(nèi)碳納米管對(duì)斑馬魚胚胎累積孵化率影響

2.4 納米TiO2對(duì)斑馬魚孵化率的影響

如圖9所示，暴露組斑馬魚胚胎96 h孵化率與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明急性暴露納米TiO2不影響斑馬魚的孵化率.圖10表明，大部分胚胎在48～60 h孵化，不同暴露組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.每組孵化胚胎在納米TiO2暴露過程中存活率為100%，并且沒有畸形現(xiàn)象出現(xiàn)，表明在本實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度下的納米TiO2急性暴露對(duì)斑馬魚胚胎的存活率與畸形率沒有顯著影響.其他研究也得到類似的結(jié)論［4，12-13］.

有研究表明腮是納米TiO2對(duì)魚類作用的靶器官.本實(shí)驗(yàn)中納米TiO2未能影響斑馬魚胚胎孵化可能是由于卵殼的保護(hù)作用.因此，低質(zhì)量濃度暴露納米TiO2從胚胎至發(fā)育成熟，對(duì)全生命周期的斑馬魚發(fā)育毒性以及組織特異性有待進(jìn)一步研究.

圖9 納米TiO2對(duì)斑馬魚胚胎96 h孵化率的影響

圖1036 ～96 h納米TiO2對(duì)斑馬魚胚胎累積孵化率的影響

3 結(jié)論

1)不同納米材料對(duì)斑馬魚的發(fā)育毒性不同，納米ZnO主要影響斑馬魚胚胎孵化率，雖然Zn2+有溶出，但對(duì)孵化率沒有顯著影響.納米ZnO還可引起斑馬魚胚胎水腫，且水腫率與暴露質(zhì)量濃度存在濃度劑量效應(yīng)關(guān)系.

2)碳納米管溶液和納米TiO2不影響斑馬魚胚胎96 h孵化率和存活率，但碳納米管可使斑馬魚胚胎短期的孵化延遲.在同等實(shí)驗(yàn)條件下，暴露質(zhì)量濃度越高，孵化延遲現(xiàn)象越顯著.納米TiO2和碳納米管在暴露時(shí)間內(nèi)對(duì)斑馬魚胚胎沒有致畸效應(yīng).

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