重組豬鼻支原體P37蛋白的原核表達(dá)及免疫原性分析

熊祺琰，劉占軍，馬慶紅，馮志新，劉茂軍，白方方，邵國青

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京 210014）

豬鼻支原體（Mycoplasma hyorhinis，Mhr）是一種能夠引起豬多發(fā)性漿膜炎[1]、關(guān)節(jié)炎[2]、耳炎[3]、肺炎[4]等病癥的致病性支原體。Mhr在臨床豬場的感染率較高，主要通過上呼吸道感染進(jìn)行傳播，該病原從呼吸系統(tǒng)向全身發(fā)生侵染將導(dǎo)致多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)生。Mhr也是細(xì)胞培養(yǎng)中引起培養(yǎng)污染的最常見支原體之一。近年來的研究表明Mhr感染與人的多種癌癥，包括胃癌[5]、大腸癌[6]、前列腺癌[7-8]等有明顯的相關(guān)性。

目前Mhr的感染檢測主要依賴于PCR方法，尚未有商品化的試劑盒可以用于血清學(xué)檢測。P37蛋白是Mhr的一種膜蛋白，為Mhr的主要免疫原之一。相關(guān)研究表明，P37蛋白在Mhr誘發(fā)細(xì)胞腫瘤化中起重要作用[9-11]。本研究采用原核系統(tǒng)表達(dá)P37重組蛋白，測定其與Mhr陽性血清的反應(yīng)性，作為建立Mhr ELISA診斷方法的包被抗原候選蛋白；同時檢測P37蛋白的免疫原性，為重組疫苗的構(gòu)建和單克隆抗體（MAb）的制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)動物 大腸桿菌（E.coli）BL-21（DE3）及表達(dá)載體pET-28a（+）均由本研究所保存；16只4周齡～6周齡雄性BALB/c小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.2 主要試劑 硝酸纖維素膜購自美國M illipore公司；鎳柱購自南京金斯瑞生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（HRP-IgG）、羊抗兔HRP-IgG和DAB顯色液均購自武漢博士德生物工程有限公司；Mhr抗體陽性兔血清及Mhr抗體陽性小鼠血清為本實(shí)驗(yàn)室自制；PCR鑒定引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，選取P37部分片段為目標(biāo)PCR片段鑒定P37，設(shè)計上游引物序列為5'-TGCTCGAATACGGGTG-3'；下游引物序列為5'-AA AAATTGGCTTGAAC-3'。

1.3 Mhr P37基因變異程度分析 檢索GenBank收錄的Mhr P37基因，同時對本實(shí)驗(yàn)室分離并單克隆后保存的12株Mhr菌株的P37基因進(jìn)行測序。利用DNAStar軟件對上述所有P37基因進(jìn)行比對，分析序列變異程度。

1.4 Mhr P37基因的獲得 根據(jù)不同菌株間P37的變異程度，選取合適的目的序列進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。為避免支原體色氨酸密碼子需要突變的問題，采用基因合成的方式獲得除信號肽外的Mhr P37蛋白全基因序列（1 140 bp），同時利用E.coli偏愛的密碼子進(jìn)行序列優(yōu)化以幫助表達(dá)。兩端分別添加NheⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。合成的基因片段經(jīng)NheⅠ和BamHⅠ雙酶切后插入經(jīng)同樣雙酶切的pET-28a（+）空質(zhì)粒載體中，構(gòu)建得到pET28a-P37重組表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，PCR篩選陽性克隆，得到的陽性克隆進(jìn)行一次單克隆，再重復(fù)篩選一次，獲得陽性菌株，測序鑒定序列的正確性。保存菌種。

1.5 重組Mhr P37蛋白的表達(dá) 接種20μL甘油管菌液至5 ML卡那抗性的LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，次日以2%的量轉(zhuǎn)接于卡那抗性的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600nm值為0.4～0.6，加IPTG至終濃度1mmol/L，37℃誘導(dǎo)，于不同時間點(diǎn)收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE（15%分離膠、5%濃縮膠），測定最佳誘導(dǎo)時間。

1.6 重組Mhr P37蛋白的制備及純化 以最佳誘導(dǎo)時間誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，收集菌體，超聲裂解，離心收集上清液。采用鎳柱親和純化重組蛋白，透析凍干保存于-20℃。

1.7 重組Mhr P37蛋白的鑒定 利用western blot方法鑒定P37蛋白。重組P37蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜（NC）上。5%脫脂奶37℃搖動封閉2 h，加入用1%脫脂奶粉和10 mmol/L PBS稀釋40倍的Mhr陽性小鼠血清，37℃搖動雜交 1 h。0.05%Tween-20，10 mmol/L PBS洗膜 5次，每次5 min。洗滌后加入用1%脫脂奶粉和10 mmol/L PBS稀釋的羊抗小鼠HRP-IgG作為二抗（1∶5 000），37℃作用1 h。同上洗滌后加入顯色液，出現(xiàn)明顯條帶后用蒸餾水沖洗膜以終止反應(yīng)。

1.8 間接ELISA方法的建立 取純化的重組Mhr P37蛋白，考馬斯亮藍(lán)試劑盒測定蛋白濃度。用包被稀釋液0.05mmol/L Na2CO3-Na2HCO3緩沖液（pH9.6）將蛋白稀釋至5μg/mL，每孔加100μL，4℃包被過夜，次日用含0.05%Tween-20的PBST溶液洗滌3次，每次5m in；每孔加入200μL 2%BSA于37℃封閉2 h，同上洗滌3次；加入1：100倍稀釋的Mhr抗體陽性或陰性兔血清樣本，每孔100μL，37℃孵育1 h，洗滌；加入羊抗兔HRP-IgG（1∶8 000），每孔100μL，37℃孵育1 h，洗滌；加入新鮮配制的TMB底物100μL，37℃避光顯色10m in；加入50μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，于450 nm波長測定。

1.9 重組Mhr P37蛋白的免疫原性分析 將小鼠隨機(jī)分成2組，每組8只。間隔2周免疫一次，共免疫3次。首次免疫采用弗氏完全佐劑乳化，后兩次采用弗氏不完全佐劑。G1組肌肉注射免疫乳化的P37蛋白，每只小鼠100μg，G2組免疫乳化的PBS作為陰性對照。不同時間點(diǎn)采血檢測血清抗體。分別以Mhr全菌蛋白和重組P37蛋白作為包被抗原，檢測P37免疫組血清的反應(yīng)性。

2 結(jié) 果

2.1 Mhr P37基因變異程度分析 GenBank中共檢索到4條Mhr P37基因序列（CP003231.1、CP002669.1、CP002170.1、X14140.1），同時對本實(shí)驗(yàn)室分離并單克隆后保存的12株Mhr菌株的P37基因進(jìn)行測序。利用DNAStar軟件對上述P37基因進(jìn)行比對，結(jié)果顯示核酸變異19處，蛋白變異9處。表明P37蛋白在各個菌株之間變異不大，屬于保守性蛋白?；诖私Y(jié)果，本試驗(yàn)利用GenBank中登錄號為X14140.1的蛋白翻譯序列為目的P37蛋白序列設(shè)計重組基因，并進(jìn)行重組質(zhì)粒的構(gòu)建。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 選取合成的P37基因的部分片段為目的片段（579 bp）設(shè)計引物，PCR鑒定P37基因的插入情況。重組質(zhì)粒pET28a-P37經(jīng)PCR擴(kuò)增得到一條與目的片段大?。?79 bp）相符的條帶，表明目的基因片段已插入質(zhì)粒pET-28a（+）中（圖1）。經(jīng)DNA測序結(jié)果正確。

圖1 重組質(zhì)粒pET28a-P37的鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasm id expressing P37

2.3 P37蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化 用IPTG誘導(dǎo)重組菌，SDS-PAGE結(jié)果表明P37蛋白獲得表達(dá)，大小為44.3 ku，與重組P37的分子量45.97 ku基本相符（圖 2）。于誘導(dǎo)后 0 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h 取樣，結(jié)果表明加入IPTG誘導(dǎo)4 h后蛋白的表達(dá)達(dá)到高峰并維持穩(wěn)定水平，故誘導(dǎo)4 h后即可收集菌體。采用鎳柱親和純化重組P37蛋白，結(jié)果顯示純化效果良好（圖2泳道4）。

圖2 重組P37蛋白的表達(dá)及純化Fig.2 Expression and purification of the recombinant P37 protein

2.4 重組Mhr P37蛋白的western blot鑒定 利用本實(shí)驗(yàn)室制備的Mhr小鼠陽性血清對重組P37蛋白進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明誘導(dǎo)后的全菌蛋白能夠被Mhr陽性血清識別，產(chǎn)生的交帶分子量大小與P37蛋白符合；而陰性對照血清無明顯陽性雜交條帶（圖3）。

2.5 間接ELISA檢測 以重組Mhr P37蛋白為包被抗原檢測Mhr陽性和陰性兔血清，結(jié)果顯示重組蛋白可以檢測到Mhr抗體（p<0.01），表明該重組P37蛋白具有明顯的反應(yīng)原性（圖4）。

2.6 重組Mhr P37蛋白的免疫原性分析 將純化的重組P37蛋白免疫小鼠，檢測其是否能夠刺激動物產(chǎn)生抗體。P37免疫后，小鼠產(chǎn)生明顯的抗P37抗體，用Mhr全菌蛋白為包被抗原檢測也呈現(xiàn)陽性，檢測值稍低于P37蛋白包被時的檢測值。結(jié)果表明該重組P37蛋白具有良好的免疫原性（圖5）。

3 討 論

圖3 重組P37蛋白的western blot鑒定Fig.3 Identification of the recombinant P37 protein

圖4 以重組P37蛋白為抗原ELISA檢測Mhr抗體Fig.4 Detection of antibody against Mhr by the ELISA assay using the recombinant P37 protein as coating antigen

Mhr是第一種從豬體內(nèi)分離到的支原體，屬于臨床豬場常見病原菌之一，感染后可以引起豬的多種炎癥性疾病。Mhr對呼吸道纖毛的損傷使得其他病原菌如多殺性巴氏桿菌、豬繁殖呼吸綜合征病毒等更容易入侵呼吸道系統(tǒng)形成共感染。

目前，Mhr的檢測手段主要包括分離培養(yǎng)、PCR[12]、免疫組化[13]及原位雜交[1]等方法。PCR方法通常使用鼻拭子及支氣管肺泡灌洗液作為待檢樣品，其中鼻拭子樣本檢出率較低，通常只適用于群體感染性的判斷，對于個體發(fā)病而言容易出現(xiàn)假陰性，支氣管肺泡灌洗液雖然可以通過麻醉動物后利用纖維支氣管鏡等儀器實(shí)現(xiàn)活體采集，但難以應(yīng)用于臨床進(jìn)行大規(guī)模采樣。同樣，免疫組化方法也需要迫殺動物后才能進(jìn)行，這不適用于臨床檢測。與此相比，血清學(xué)檢測是臨床主要的檢測手段。劉星等利用Mhr特異性MAb建立了阻斷ELISA方法檢測血清中Mhr[14]，但目前市場上尚無商品化售賣的Mhr血清抗體檢測試劑盒。

P37蛋白是Mhr的一種膜蛋白，近年來的研究表明P37蛋白在Mhr誘發(fā)腫瘤中起重要作用，其機(jī)制可能包括誘導(dǎo)單核細(xì)胞表達(dá)和釋放TNF-α[9]、激活金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-2及表皮生長因子受體的磷酸化等[10]。在本研究中，構(gòu)建了能夠在大腸桿菌中優(yōu)化表達(dá)Mhr P37蛋白的重組質(zhì)粒，可以在原核系統(tǒng)大量表達(dá)P37蛋白，經(jīng)親和層析得到純度較高的P37重組蛋白。該蛋白可以與Mhr陽性血清雜交產(chǎn)生陽性條帶，以其為包被抗原能夠檢測Mhr陽性血清，這為進(jìn)一步建立和優(yōu)化血清學(xué)ELISA檢測方法提供可能。另外，免疫試驗(yàn)證明該重組P37蛋白也具有良好的免疫原性，可以產(chǎn)生Mhr反應(yīng)性的抗體，為Mhr重組疫苗及P37相關(guān)重組腫瘤疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

圖5 重組P37蛋白的免疫原性分析Fig.5 Immunogenicity analysis of the recombinant P37 protein

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