酶活性、丙二醛含量變化與苦瓜抗枯萎病的關(guān)系

趙秀娟 ，唐 鑫 ，程蛟文 ，李衛(wèi)鵬 ，譚 澍，胡開林

(1 廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510430;2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642)

苦瓜枯萎病是由尖鐮孢菌苦瓜?；?Fusarium oxysporum f.sp.momordicae Sun＆Huang)侵染而引起的土傳病害［1］，是苦瓜生產(chǎn)中遇到的最嚴(yán)重病害之一，在我國各苦瓜種植區(qū)均有發(fā)生，其發(fā)病率一般為15%～25%，病重時高達(dá)60%～80%，嚴(yán)重影響苦瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)［2］.

許多學(xué)者對病原菌侵染植株后寄主表現(xiàn)的抗病機理進(jìn)行了研究.例如在瓜類抗枯萎病機理研究中，有學(xué)者認(rèn)為某些抗病品種之所以抗病是因為其本身在組織結(jié)構(gòu)和(或)生理生化和(或)遺傳等方面存在抗病因子——指“即存抗性”［3］，如:抗病品種通常具有抑制病菌孢子萌發(fā)的凝集素，細(xì)胞壁含有較多的木質(zhì)素［4］;西瓜子葉中的硬脂酸［5］、根系的SOD活性［6］、幼苗體內(nèi)的抗壞血酸氧化酶活性及根系中的乙酸和檸檬酸含量［7］，黃瓜的過氧化酶活性［8］等.盡管在瓜類枯萎病抗性生理生化方面的研究存在一些不同的結(jié)論［9］，但有些指標(biāo)已運用于瓜類抗性品種的篩選、鑒定與育種工作中［8，10-11］.迄今為止，對苦瓜枯萎病抗性的生理生化相關(guān)研究鮮見報道.

本試驗以苦瓜高抗枯萎病的自交系‘0417'和高感自交系‘472113'為材料，通過苗期人工接種苦瓜枯萎病菌，探討苦瓜幼苗植株體內(nèi)一系列防御酶如苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、幾丁質(zhì)酶(CHT)和β-1，3 葡聚糖酶(GUN)的活性及丙二醛(MDA)含量的變化與抗病性的關(guān)系，試圖通過這幾種酶的活性與材料抗病性的關(guān)系，為苦瓜枯萎病機理的研究提供一些參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

苦瓜‘0417'是斯里蘭卡野生種經(jīng)6 代自交純化獲得的抗病自交系，苦瓜‘472113'是廣州本地的大頂苦瓜經(jīng)8 代自交純化獲得的感病自交系，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院蔬菜系提供.苦瓜枯萎病菌由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，接種菌液的孢子密度為4×106mL-1.

1.2 方法

1.2.1 育苗、接種與培養(yǎng) 供試苦瓜種子經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的高錳酸鉀溶液處理30 min，30℃條件下浸種10 h 后，在28℃恒溫箱中催芽，然后播于滅過菌的培養(yǎng)土中.置于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)測試中心的人工氣候室進(jìn)行育苗［θ=(28±1)℃，相對濕度(RH)=90%，每天光照12 h (4 000 lx)］.

當(dāng)幼苗長至3～4 片真葉時拔出，洗凈根部泥土，將每5 株幼苗放入霍格蘭營養(yǎng)液100 mL/瓶(加入苦瓜枯萎病菌，調(diào)至孢子密度為4×106mL-1)中培養(yǎng)，對照為不加入枯萎病菌孢子的霍格蘭營養(yǎng)液.3 次重復(fù)，分接種與不接種2 個處理，每處理80 株.

幼苗接種后仍然置于人工氣候室中進(jìn)行培養(yǎng)，接種后48 h 內(nèi)黑暗培養(yǎng)，RH 100%，溫度(28±1)℃;48 h后與育苗條件相同.

1.2.2 取材與酶液制備 分別于接種前(0 d)、接種后每隔24 h 取樣，連續(xù)7 次.分別取苦瓜幼苗的葉片和莖基部(根部以上至第1 真葉以下)用于生理指標(biāo)的測定.每個處理隨機取10 株，設(shè)3 次重復(fù).將樣品稱質(zhì)量后(約0.6 g)放入-80℃冰箱中保存待用.

PPO、POD、SOD、CAT、MDA、CHT 和GUN 酶液的制備:分別取各處理材料按照質(zhì)量體積比(g/mL)1∶9 的比例加入5.4 mL 0.1 mol/L 的磷酸緩沖液(PBS)(pH=7.0)，研磨，4℃條件下8 000 r/min 離心20 min，取上清液即為待測酶液.

PAL 酶液的制備:分別取各處理材料按照質(zhì)量體積比(g/mL)1∶9 的比例加入5.4 mL 0.1 mol/L 的硼酸緩沖液(pH=8.8，含5 mmol/L 巰基乙醇、1 mmol/L EDTA)，研磨，4℃條件下8 000 r/min 離心20 min，取上清液待測.

1.2.3 酶活性和MDA 含量測定 POD、SOD、CAT活性和MDA 含量的測定使用南京建成生物工程研究所的試劑盒.POD 以每毫克鮮質(zhì)量每分鐘催化產(chǎn)生1 μg 底物的酶量為1 個酶活力單位(U)，CAT 以每毫克鮮質(zhì)量每秒鐘分解1 μmol H2O2的量為1 個酶活力單位(U)，SOD 以每克鮮質(zhì)量在1 mL 反應(yīng)液中SOD 抑制率達(dá)50%時所對應(yīng)的SOD 量為1 個酶活力單位(U).

PPO、PAL、CHT 和GUN 的測定使用上海博耀生物科技有限公司的酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒.用酶標(biāo)儀在450 nm 波長下測定光密度(D450nm)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中PPO、PAL 和GUN 的活性.以每分鐘光密度變化0.01 所需酶量為1 個酶活力單位(U).

2 結(jié)果與分析

2.1 PPO 活性與抗性的關(guān)系

接種后抗、感自交系的莖基部PPO 活性均呈明顯升高的趨勢，其中抗病自交系的PPO 活性無論是升高速度還是峰值均高于感病自交系和對照，尤其是接種后第2 天，抗病自交系PPO 活性增加顯著，分別比對照和感病自交系增加124.2%和77.1%［F=8 269.66，P=0(P＜0.01)］，差異達(dá)到極顯著水平;抗、感自交系的PPO 活性均在接種后第6 天達(dá)到峰值(圖1a).

從圖1b 可看出，接種后的抗病自交系其葉片PPO 活性比感病自交系增加顯著，尤其是第4 天增加幅度最大且達(dá)到最高值，比未接種對照增加202.9%，比感病自交系增加167.4%［F=6 274.40，P=0(P＜0.01)］，差異達(dá)到極顯著水平.感病自交系第6 天上升幅度較大且達(dá)到峰值，此時比未接種對照增加92.3%.

圖1 接種苦瓜枯萎病菌后莖基部和葉片PPO 活性變化Fig.1 The variation of PPO activity of the bitter gourd stem base and leaves after inoculation with Fusarium oxysporum

2.2 POD 活性與抗性的關(guān)系

接種后的抗病自交系莖基部POD 活性于第3 天達(dá)到峰值，比未接種對照高8.8%，比感病自交系高6.6%［F=22.105，P=0.009(P＜0.01)］，差異達(dá)到極顯著水平;感病自交系酶活性在第4 天達(dá)到峰值，比未接種對照高6.8%(圖2a).圖2b 顯示，接種后的抗、感自交系其葉片POD 酶活性峰值分別出現(xiàn)在第1、第3 天，比其未接種對照分別高16.3%、6.2%;抗病自交系POD 酶活性于第1 天比感病自交系高14.6% ［F=744.42，P=0(P＜0.01)］，差異極顯著.抗、感病自交系莖基部的酶活性升高幅度比葉片大，但葉片POD 活性峰值出現(xiàn)的時間比莖基部早.

圖2 接種苦瓜枯萎病菌后莖基部和葉片POD 活性變化Fig.2 The variation of POD activity of the bitter gourd stem base and leaves after inoculation with Fusarium oxysporum

2.3 SOD 活性與抗性的關(guān)系

接種后的抗病自交系莖基部SOD 活性于第5 天達(dá)到峰值，比未接種對照增加13.1%，比感病自交系增加17.3% ［F=247.02，P=0(P＜0.01)］，差異極顯著;感病自交系在第1～4 天上升快，第4 天達(dá)到最高值，比未接種對照高出16.2%(圖3a).而抗病自交系其葉片SOD 酶活性高峰出現(xiàn)在第2 天，比未接種對照高10.1%，比感病自交系高8.8%［F=303.38，P=0(P＜0.01)］，差異達(dá)到極顯著水平;感病自交系酶活性高峰出現(xiàn)在第3 天，比未接種對照高6.2%(圖3b).從SOD 活性變化看，莖基部的酶活性變化幅度比葉片大，但葉片酶活性峰值出現(xiàn)的時間比莖基部早.

圖3 接種苦瓜枯萎病菌后莖基部和葉片SOD 活性變化Fig.3 The variation of SOD activity of the bitter gourd stem base and leaves after inoculation with Fusarium oxysporum

2.4 PAL 活性與抗性的關(guān)系

從整體水平看，接種后的抗病自交系其莖基部PAL 活性高于感病自交系，于第3、4 、5 天分別比感病自交系高22.8%、19.4%、16.5%，并于第6 天達(dá)到峰值，比其未接種對照增加33.3%，比感病自交系高29.5%［F=129.45，P=0(P＜0.01)］，差異達(dá)到極顯著水平(圖4a).

接種枯萎病菌后，抗、感自交系葉片PAL 活性升高幅度較大.抗病自交系于第3 天達(dá)到峰值，比未接種對照增加15.2%，比感病自交系增加17.8% ［F=506.45，P=0(P＜0.01)］，差異達(dá)到極顯著水平;感病自交系在第4 天達(dá)到高峰，比對照增加18.0%(圖4b).抗、感病自交系其葉片PAL 活性峰值出現(xiàn)的時間比莖基部早.

圖4 接種苦瓜枯萎病菌后莖基部和葉片PAL 活性變化Fig.4 The variation of PAL activity of the bitter gourd stem base and leaves after inoculation with Fusarium oxysporum

2.5 CAT 活性與抗性的關(guān)系

接種后，抗、感自交系莖基部CAT 活性均在第4天達(dá)到最高，分別比其對照增加23.9%、18.9%，但抗病自交系比感病自交系僅高出7.0%［F=2.96，P=0.16(P＞0.05)］，差異不顯著(圖5a).從圖5b可看出，接種后的抗、感自交系其葉片CAT 活性均于第3 天達(dá)到峰值，在第4 、6 天抗病自交系分別比感病自交系高17.5%［F=16.72，P=0.015(0.01＜P＜0.05)］和20.9%［F=10.40，P=0.032(0.01＜P＜0.05)］，差異達(dá)顯著水平.葉片的CAT 活性變化幅度比莖基部大，但抗、感病自交系的葉片CAT 活性峰值出現(xiàn)的時間比莖基部早.

2.6 MDA 含量與抗性的關(guān)系

接種后，抗、感自交系莖基部MDA 含量迅速上升，分別于第6 、4 天達(dá)到峰值，比其未接種對照增加128.6%、109.1%;感病自交系的MDA 含量高于抗病自交系，并于第4 天比抗病自交系高76.9%［F=60.0，P=0.001(P＜0.01)］，差異達(dá)極顯著水平(圖6a).而感病自交系葉片MDA 含量于第3、5 天分別比抗病自交系高出53.8%、47.1%，它們均于第6 天達(dá)到峰值，感病自交系比其未接種對照增加81.8%，比抗病自交系高145.5%［F=147.0，P=0(P＜0.01)］，差異也達(dá)極顯著水平(圖6b).

圖5 接種苦瓜枯萎病菌后莖基部和葉片CAT 活性變化Fig.5 The variation of CAT activity of the bitter gourd stem base and leaves after inoculation with Fusarium oxysporum

總之，MDA 含量與苦瓜抗病性呈負(fù)相關(guān).但感病自交系其莖基部MDA 含量的峰值出現(xiàn)時間比抗病自交系早，葉片變化幅度大于莖基部.

2.7 CHT 活性與抗性的關(guān)系

接種后的抗病自交系其莖基部CHT 活性于第6天達(dá)到峰值，比未接種對照增加56.1%，比感病自交系增加37.6%［F=25.29，P=0.007(P＜0.01)］，差異達(dá)極顯著水平;感病自交系也于第6 天酶活性達(dá)峰值，比未接種對照增加29.3%(圖7a).抗病自交系其葉片CHT 活性于第5 天達(dá)到峰值，比未接種對照增加49.3%，比感病自交系增加31.5%［F=37.36，P=0.004(P＜0.01)］，差異達(dá)極顯著水平;感病自交系酶活性在第6 天達(dá)最大值，比未接種對照增加24.8%(圖7b).葉片的CHT 活性變化幅度比莖基部小，但抗、感病自交系其葉片CHT 活性峰值出現(xiàn)的時間比莖基部早.

圖6 接種苦瓜枯萎病菌后莖基部和葉片MDA 含量變化Fig.6 The variation of MDA content of the bitter gourd stem base and leaves after inoculation with Fusarium oxysporum

圖7 接種苦瓜枯萎病菌后莖基部和葉片CHT 活性變化Fig.7 The variation of CHT activity of the bitter gourd stem base and leaves after inoculation with Fusarium oxysporum

2.8 GUN 活性與抗性的關(guān)系

接種后的抗病自交系于第6 天GUN 活性達(dá)到峰值，但第4 天升高幅度明顯，比未接種對照高41.5%，比感病自交系高出28.2%［F=344.03，P=0(P＜0.01)］，差異達(dá)到極顯著水平;感病自交系也于第6 天酶活性達(dá)到峰值，比未接種對照高30.1%(圖8a).而抗病自交系其葉片GUN 活性升高幅度大，于第4 天酶活性達(dá)到峰值，比未接種對照增加55.3%，比感病自交系增加52.8%［F=2 982.87，P=0(P＜0.01)］，差異達(dá)極顯著水平;感病自交系葉片GUN 活性于第6 天升高幅度大而達(dá)到峰值，比未接種對照增加28.0%(圖8b).總之，抗、感自交系其莖基部和葉片均于第4 天GUN活性差異達(dá)到極顯著水平，葉片的酶活性變化幅度比莖基部大，葉片GUN 活性峰值出現(xiàn)的時間比莖基部早.

圖8 接種苦瓜枯萎病菌后莖基部和葉片GUN 活性變化Fig.8 The variation of GUN activity of the bitter gourd stem base and leaves after inoculation with Fusarium oxysporum

3 討論與結(jié)論

綜合本研究結(jié)果，苦瓜幼苗接種枯萎病菌后，除MDA 含量與抗病性呈負(fù)相關(guān)外，其余7 種酶活性與抗病性呈正相關(guān).無論莖基部還是葉片的PPO、PAL、POD、SOD、CHT 和GUN 活性，抗病自交系都極顯著高于感病自交系，表現(xiàn)出一致性;此外，從葉片的CAT 活性來看，抗病自交系也顯著高于感病自交系.鑒于此，初步認(rèn)為可用PPO、PAL、CAT、CHT、GUN、POD、SOD 活性和MDA 含量的峰值大小作為鑒定苦瓜品種或植株枯萎病抗性的生理指標(biāo).其中，首選PPO 活性，其次是CHT、GUN 活性和MDA 含量，因為它們的變化與苦瓜枯萎病抗性關(guān)系較為密切.

3.1 PPO、POD、SOD 活性與抗病性的關(guān)系

在抗病機制的研究中，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為PPO 的含量與抗病性成正比.普遍認(rèn)為植物感染病原菌后，POD 活性顯著增強，感染后植株體內(nèi)的POD 活性變化趨勢呈一上升的單峰曲線，也有曲線中存在2 個酶峰的［10-12］;但有相反結(jié)論，認(rèn)為植株感病后POD活性上升，但感病品種活性明顯高于抗病品種［13］.多數(shù)研究認(rèn)為，SOD 活性與抗病性存在正相關(guān).本試驗表明，苦瓜接種枯萎病菌后，抗、感自交系的PPO、POD、SOD 活性均有升高的趨勢，但抗病自交系比感病自交系升高幅度更大且峰值出現(xiàn)時間更早，抗、感自交系酶活性差異達(dá)到極顯著水平.莖基部的酶活性變化幅度大于葉片，符合枯萎病菌從根部侵染后就在根、莖基部產(chǎn)生感染的變化趨勢，也反映出根、莖維管束感染也影響到葉片的生理生化變化.

3.2 PAL 活性與抗病性的關(guān)系

一般由親和性互作引起的感病反應(yīng)中PAL 活性降低，非親和性互作引起的抗病反應(yīng)中PAL 活性升高，PAL 活性與抗病性呈正相關(guān)，許多研究證明了這一點［11，14］.本研究表明，苦瓜幼苗接種枯萎病菌后，抗病自交系PAL 高于感病自交系，抗、感自交系PAL活性差異極顯著.抗、感病自交系葉片PAL 活性峰值出現(xiàn)的時間比莖基部早，其原因有待進(jìn)一步研究.

3.3 CAT 活性和MDA 含量與抗病性的關(guān)系

前人的大量研究表明，CAT 活性越強則植物的抗病性也越強，而MDA 含量與抗病性呈負(fù)相關(guān)［15-16］.本結(jié)果表明，苦瓜幼苗接種枯萎菌后，抗病自交系CAT 活性高于感病自交系，這可能與其發(fā)揮防御傷害能力增強有關(guān).抗、感病自交系的葉片CAT活性峰值出現(xiàn)的時間比莖基部早;但葉片的酶活性變化幅度比莖基部大，這與王玲平［16］的研究報道不一致.而感病自交系MDA 含量始終高于抗病自交系，即MDA 含量與苦瓜抗性呈負(fù)相關(guān);葉片MDA 含量變化幅度大于莖基部，這與王玲平［16］的研究報道也不一致.

3.4 CHT 和GUN 活性與抗病性的關(guān)系

CHT 和GUN 在離體條件下可聯(lián)合抑制病原菌，它們的轉(zhuǎn)基因植物對病原菌的抗性比未經(jīng)轉(zhuǎn)基因的野生種強［17-18］，證實了CHT 和GUN 在植物抗病中的重要作用.苦瓜在接種枯萎菌后，抗、感病自交系CHT 和GUN 活性均上升，可認(rèn)為是對病菌侵染的一種防衛(wèi)反應(yīng)，加強對枯萎菌侵染的抑制作用.同時，抗病自交系葉片CHT、GUN 活性升高比感病自交系早且快，也反映出抗病自交系在受到病原菌的侵入后引起的防御反應(yīng)比感病自交系快，從而抑制病原菌的進(jìn)一步入侵.

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