熒光顯微鏡觀察封閉式脊髓窗內(nèi)的大鼠脊髓微循環(huán)

苑曉晨，李炳蔚，武清斌，荊瀛黎，盛有明，李宏偉，劉淑英，修瑞娟

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院微循環(huán)研究所，北京100005)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)的治療是世界性難題，探討其發(fā)展機(jī)制具有重要意義。微循環(huán)起著維持組織細(xì)胞正常功能活動(dòng)的作用，可以將其作為研究 SCI的切入點(diǎn)［1－2］。采用激光多普勒技術(shù)、氫電極技術(shù)等方法觀察脊髓微循環(huán)得出的相對(duì)數(shù)值只能間接地反映微循環(huán)的變化，直觀性不夠。而國(guó)內(nèi)報(bào)道的脊髓窗技術(shù)僅能對(duì)血管的管徑進(jìn)行測(cè)量，無(wú)法觀測(cè)紅細(xì)胞(red blood cell，RBC)的流動(dòng)和白細(xì)胞的黏附。此外，這些方法剝離了硬脊膜，需要通過(guò)不斷的進(jìn)行人工腦脊液的恒溫灌流來(lái)維持脊髓的腦脊液平衡，為觀察脊髓損傷的慢性病變帶來(lái)不便。

本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)熒光標(biāo)記示蹤法來(lái)觀察脊髓軟脊膜血管內(nèi)RBC的運(yùn)動(dòng)和白細(xì)胞的黏附滾動(dòng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)脊髓窗內(nèi)微循環(huán)的有效觀測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑:丙烯酸樹脂(3M公司)，α-氰基丙烯酸正丁酯生物膠(康派特公司)，1，1'-Dioctadecyl-3，3，3'，3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate(Dil)和Rhodamine 6G(Sigma公司)。Dil工作液的配制與貯存:0.5 mg Dil溶于1 mL無(wú)水乙醇，室溫避光保存。將3 mg Rhodamine 6G溶于10 mL 0.9%氯化鈉注射液中，4℃避光保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:本研究涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院微循環(huán)研究所倫理委員會(huì)審核、批準(zhǔn)。SD大鼠［北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK(京)2011-0011］，8周齡雄性，清潔級(jí)，體質(zhì)量250±10 g。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物麻醉:腹腔注射10%水合氯醛，0.3 mL/100 g，5～10 min后動(dòng)物進(jìn)入麻醉狀態(tài)。將動(dòng)物置于恒溫電熱板上進(jìn)行操作。

1.2.2 脊髓窗模型的制作:在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)［3］。暴露T9至T11胸椎的椎板。用半凝固的丙烯酸樹脂涂抹在大鼠T9和T11的棘突上，形成一個(gè)球狀物，便于椎體固定器的夾持。在T10椎板上開窗，暴露脊髓但不破壞硬脊膜。磨鉆打磨開窗邊緣及T9和T11椎板表面，以外徑為4.5 mm的塑料管為模具，將半凝固的丙烯酸樹脂涂抹在模具和骨窗周圍，待其快凝固時(shí)將塑料管拔出，丙烯酸樹脂可形成一個(gè)井型空間。將丙烯酸樹脂窗的上表面打磨平整后涂抹生物膠，黏接蓋玻片，封閉脊髓窗(圖1)。

1.2.3 RBC的分離和熒光標(biāo)記:參考相關(guān)文獻(xiàn)［4－5］步驟如下:眼眶取血500 μL，肝素抗凝，4℃，2 000×g離心5 min。吸棄上層血清和中層的白細(xì)胞。用林格氏液洗滌離心，獲得洗滌后的RBC。取100 μL壓積 RBC置于10 mL林格氏液中，向林格氏液中加入100 μL的Dil工作液，避光室溫孵育30 min。孵育完成后反復(fù)洗滌并離心標(biāo)記后的RBC，直至上清液中無(wú)Dil的紅色，即獲得可輸注的熒光標(biāo)記紅細(xì)胞 (Dil-RBC)。最后向收集到的RBC中加入100 μL的林格氏液，充分混勻后備用。

1.2.4 大鼠脊髓窗內(nèi)的熒光影像觀察:將大鼠置于動(dòng)物活體熒光顯微系統(tǒng)下進(jìn)行觀察 (圖2):大鼠微循環(huán)觀測(cè)椎體固定器將大鼠的T9和T11的棘突夾持固定，從而降低胸腔起伏造成的對(duì)焦干擾。觀測(cè)血流速度時(shí)，通過(guò)頸靜脈插管注射200 μL的Dil-RBC溶液，活體熒光顯微鏡下觀察 (綠色激發(fā)光);觀察白細(xì)胞黏附時(shí)，通過(guò)大鼠頸靜脈緩慢推注Rhodamine 6G工作液1 mL，綠色激發(fā)光源照射下觀察。Rhodamine 6G能夠標(biāo)記白細(xì)胞 (多核粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞)，而不會(huì)標(biāo)記RBC［6－7］。

圖1 大鼠封閉脊髓窗結(jié)構(gòu)示意圖Fig 1 Schematic illustration of the closed spinal window

2 結(jié)果

2.1 封閉式脊髓窗觀測(cè)

通過(guò)改進(jìn)的封閉式脊髓窗，可以觀察到大鼠脊髓背側(cè)軟脊膜內(nèi)的多根靜脈血管。呼吸造成的運(yùn)動(dòng)不會(huì)阻礙通過(guò)脊髓窗觀察血管形態(tài)、分布特點(diǎn)和血管密度;普通的落射光源下可以清晰的觀察血管網(wǎng)的分布、管徑和迂曲度等(圖3)。

2.2 RBC染色及觀測(cè)

體外觀察Dil孵育后的RBC，綠色激發(fā)光下可見RBC呈現(xiàn)橙紅色，細(xì)胞形態(tài)正常，沒(méi)有其他細(xì)胞碎片的存在(圖4)。通過(guò)綠色激發(fā)光可以清晰的觀察到RBC在血管內(nèi)的運(yùn)動(dòng)軌跡(圖5)。采用細(xì)胞的匯聚和分散的方向來(lái)區(qū)分動(dòng)脈和靜脈。細(xì)胞逐漸匯聚的為靜脈，細(xì)胞逐漸分散的為動(dòng)脈。

2.3 白細(xì)胞染色及觀測(cè)

在靜脈注射羅丹明6G之后，持續(xù)觀察。10 min后可見白細(xì)胞在靜脈內(nèi)壁上黏附滾動(dòng)(圖6)。

3 討論

圖6 在靜脈上黏附的羅丹明6G標(biāo)記的白細(xì)胞Fig 6 The Rhodamine 6G-labelled leukocytes adherent to vessels

SCI的病理?yè)p害分為原發(fā)性和繼發(fā)性。繼發(fā)性損傷的機(jī)制之一包括血管破壞和痙攣，血細(xì)胞的黏附及阻塞等［8］。相關(guān)結(jié)果多來(lái)自于免疫組織化學(xué)，活體監(jiān)測(cè)脊髓微循環(huán)的研究較少。目前監(jiān)測(cè)脊髓微循環(huán)有一定難度。脊髓被包繞在一個(gè)相對(duì)較為復(fù)雜的環(huán)境中(骨、脂肪、靜脈叢及腦脊液)。營(yíng)養(yǎng)脊髓的各級(jí)血管管徑差異小，造影劑充盈效果較差，從而使核磁共振檢測(cè)技術(shù)不適合于用于脊髓的檢測(cè)［9］。

有學(xué)者曾經(jīng)使用“封閉式脊髓窗”對(duì)大鼠脊髓軟脊膜進(jìn)行微循環(huán)觀察［3］。但是使用普通的斜射光和垂直落射光，硬脊膜會(huì)將光線反射造成成像不清。此外，該方法僅能觀測(cè)血管管徑的變化，無(wú)法檢測(cè)血細(xì)胞的流動(dòng)和黏附滾動(dòng)等微循環(huán)狀態(tài)。如果將硬脊膜剝離，為了保證腦脊液壓力的穩(wěn)定，需要用人工腦脊液恒溫持續(xù)灌流。此種方法需要將灌流管、灌流泵和恒溫系統(tǒng)等設(shè)備與動(dòng)物模型進(jìn)行對(duì)接，比較適合于急性期的觀察，對(duì)于損傷后的長(zhǎng)期的觀察不太適用。本實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)在于:維持硬脊膜的完整，不需要人工腦脊液的恒溫灌流，為慢性實(shí)驗(yàn)觀察提供了條件。不破壞硬脊膜，也符合經(jīng)典的Allen's打擊模型的制造標(biāo)準(zhǔn)［10］。此外，本實(shí)驗(yàn)熒光標(biāo)記體內(nèi)的RBC和白細(xì)胞(多核粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核/巨噬細(xì)胞)，使得觀測(cè)直觀準(zhǔn)確，為探討血細(xì)胞在脊髓損傷中的變化提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)［11］。而使用專門的背側(cè)固定裝置，則可以減少呼吸運(yùn)動(dòng)對(duì)圖像的干擾。

綜上所述，通過(guò)改進(jìn)的封閉式脊髓窗和微循環(huán)觀測(cè)椎體固定器，結(jié)合分子影像學(xué)手段，達(dá)到了對(duì)大鼠軟脊膜上微血管的形態(tài)特點(diǎn)、RBC運(yùn)行狀態(tài)和白細(xì)胞的血管壁黏附滾動(dòng)進(jìn)行觀察和檢測(cè)的目的，為脊髓微血管研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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