不同產(chǎn)地生、干、炮姜的UPLC指紋圖譜比較研究

韓燕全， 洪 燕， 桂 潔，， 高家榮， 汪永忠， 夏倫祝*

(1.安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230031;2.安徽中醫(yī)學(xué)院，安徽合肥 230031)

生姜為姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的新鮮根莖，具有解表散寒、化痰止咳、溫中止嘔、解魚(yú)蟹毒等功效［1］。中醫(yī)藥學(xué)自古認(rèn)為藥食同源，姜是最好的范例。早在春秋時(shí)期的《論語(yǔ)·鄉(xiāng)黨》一書(shū)中就有孔子“不撤姜食，不多食”的記載。傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)認(rèn)為，姜乃藥中佳品，主治風(fēng)寒感冒、喘咳、嘔吐、痰飲、脹滿、泄瀉等，含姜的方劑和中成藥也數(shù)目眾多?，F(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)也已證明，姜具止嘔、強(qiáng)心、抗炎等作用，對(duì)感冒、嘔吐和咳嗽等疾病有良好的治療效果，對(duì)心腦血管疾病、腫瘤的發(fā)生，有一定的防治作用［2］。生姜產(chǎn)地廣泛，我國(guó)大部分地區(qū)均有出產(chǎn)，南方以廣東、浙江栽培較為普遍，其次是江西、安徽、四川、云南、湖南、湖北等省;在北方則以山東為主要產(chǎn)地，還有河南、陜西等省栽培較多［3］。眾所周知，藥材的質(zhì)量與產(chǎn)地的氣候、土壤、陽(yáng)光、水分等自然條件和生長(zhǎng)環(huán)境密切相關(guān)，這些因素不僅影響著藥材的生長(zhǎng)發(fā)育和分布，而且影響其外部形態(tài)、內(nèi)部構(gòu)造和生理變異以及有效成分的形成和含有量［4］。目前生姜藥材質(zhì)量控制與品質(zhì)評(píng)價(jià)的方法主要側(cè)重于單一或幾種成分的定量測(cè)定［2］。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)研究了全國(guó)主要產(chǎn)地生、干、炮姜藥材的UPLC指紋圖譜，為全面評(píng)價(jià)生、干、炮姜的質(zhì)量及炮制前后的質(zhì)量差異提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

超高效液相色譜儀 (Waters Acquity H-Class UPLC，美國(guó)沃特世公司)包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、柱溫箱、PDA檢測(cè)器以及Empower 2工作站;超聲儀 (江蘇昆山超聲儀器有限公司);HFB—200型高速中藥粉碎機(jī) (吉首市中州市中藥機(jī)械廠)，DZF—6050型真空干燥箱 (上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠)，炒藥設(shè)備 (自制)。

乙腈為色譜純 (美國(guó)TEDIA公司);乙醇、磷酸等試劑均為分析純;屈臣氏蒸餾水;0.2 μm微孔濾膜 (上海陸納生物科技有限公司)。對(duì)照品批號(hào)分別為:姜酮 (122-485)、6-姜酚 (23513-146)、8-姜酚 (23513-088)和 10-姜酚 (23513-157)由上海鼎瑞化工有限公司提供，經(jīng)1HNMR、13C-NMR、MS、IR和UV等光譜檢測(cè)確認(rèn)其結(jié)構(gòu) (由上海華東師范大學(xué)理工學(xué)院物理學(xué)系余亦華教授測(cè)定);按本方法色譜條件，歸一化法測(cè)得姜酮、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚純度分別為98.51%、98.79%、98.81%和99.13%。生姜藥材購(gòu)于全國(guó)不同省份的原產(chǎn)地，經(jīng)安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院韓燕全博士鑒定均為姜科植物姜Zingiber officinaliesRosc的新鮮根莖，采收后按照產(chǎn)地方法埋于潮而不濕的沙土中保存，稱量前按《中國(guó)藥典》2010年版附錄Ⅷ項(xiàng)下水分測(cè)定法，以甲苯法測(cè)定含水率;各產(chǎn)地干姜參考本課題前期研究結(jié)果，用晾法制備［5］;各產(chǎn)地炮姜按照《中國(guó)藥典》2010年版附錄“砂燙法”統(tǒng)一制備，生姜樣品信息見(jiàn)表1。

表1 17批不同產(chǎn)地生姜樣品Tab.1 Seventeen batches samples of fresh ginger from different habitats

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定姜酮、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚對(duì)照品，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液;分別取對(duì)照品貯備液各1.0 mL置10 mL量瓶中，作為對(duì)照品稀釋液;再分別取對(duì)照品稀釋液1.0、2.5、0.5、1.0 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得質(zhì)量濃度為0.042 6、0.087 55、0.013 82、0.034 2 mg/mL的姜酮、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 分別精密稱取表1中各產(chǎn)地生姜1.25 g左右 (去除含水率，取樣量與干姜、炮姜一致)、干姜和炮姜粉末0.25 g左右，置10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，超聲 (150W，40Hz)25 min，放冷，稱量，加甲醇補(bǔ)足失質(zhì)量，搖勻，0.2 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 生、干、炮姜UPLC指紋圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱 (2.1 mm×100 mm，1.7 μm);乙腈 (A)-水溶液 (B)為流動(dòng)相，梯度洗脫［程序?yàn)锳-B:0～10 min(3∶97);10～15 min(85∶15);15～18 min(100∶0);18～20 min(97∶3)］，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，體積流量為0.35 mL/min，柱溫為35℃。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取S2(江蘇徐州產(chǎn))干姜的供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》(2004版A)評(píng)價(jià)，相似度結(jié)果都在0.99以上，表明儀器的精密度良好。

2.3.3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批S3(山東沂水產(chǎn))干姜藥材，按2.2項(xiàng)下方法平行操作，制備6份供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》 (2004版A)評(píng)價(jià)，相似度結(jié)果都在0.98以上，表明樣品的重現(xiàn)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1(江西崇仁產(chǎn))干姜藥材按2.2項(xiàng)下制備供試品溶液，分別在0、4、8、12、24 h分別進(jìn)樣，檢測(cè)指紋圖譜，以《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》(2004版A)評(píng)價(jià)，相似度結(jié)果都在0.98以上，表明樣品的穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)果

3.1 不同產(chǎn)地生、干、炮姜指紋圖譜的建立及技術(shù)參數(shù)

3.1.1 UPLC指紋圖譜的建立及共有指紋峰的標(biāo)定 取不同產(chǎn)地的生、干、炮姜藥材，按2.2項(xiàng)下制備樣品溶液，在2.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定樣品的指紋圖譜。分別得到生、干、炮姜各17批樣品圖譜。根據(jù)中國(guó)藥典委員會(huì)頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》 (2004版A)處理圖譜，通過(guò)比較17批供試品UPLC色譜圖的檢測(cè)結(jié)果，確定生、干、炮姜的共有指紋峰分別為:16、22、20個(gè)，17批不同產(chǎn)地生、干、炮姜藥材的特征指紋圖譜見(jiàn)圖1、2和3。

圖1 生姜飲片的UPLC指紋圖譜Fig.1 UPLC chromatogram of 17 batches of fresh ginger samples

圖2 干姜飲片的UPLC指紋圖譜Fig.2 UPLC chromatogram of 17 batches of dried ginger samples

圖3 炮姜飲片的UPLC指紋圖譜Fig.3 UPLC chromatogram of 17 batches of processed ginger samples

3.1.2 共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積計(jì)算生姜的6號(hào)、干姜和炮姜的8號(hào)色譜峰經(jīng)對(duì)照品定性，鑒定為6-姜酚，其峰面積占總峰面積大于10%，且較穩(wěn)定，因此選其為參照峰，標(biāo)為S。分別將各共有色譜峰保留時(shí)間與同一圖譜中參照峰的保留時(shí)間比較，其比值作為各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間;將各色譜峰峰面積與同一圖譜中參照峰的峰面積比較，其比值為各色譜峰的相對(duì)峰面積。17批樣品中各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1.5%，各共有峰相對(duì)峰面積RSD＜4.0%，符合指紋圖譜的有關(guān)規(guī)定［6］。

3.2 生、干、炮姜指紋圖譜的直觀比較 將生、干、炮姜的對(duì)照指紋圖譜導(dǎo)出，與混合對(duì)照品圖譜比對(duì)，確定部分峰歸屬并進(jìn)行直觀比較分析。圖4中可見(jiàn)生、干、炮姜在a、b、c、d、e和f區(qū)域的色譜峰有明顯的差異，其中a和c區(qū)色譜峰，生姜的紫外吸收較強(qiáng)，而干姜和炮姜均較弱，說(shuō)明在炮制過(guò)程中成分有明顯的損失;b區(qū)與混合對(duì)照品定性比較可確定是姜酮的色譜峰，此峰為炮姜所獨(dú)有，是干姜在炮制過(guò)程中產(chǎn)生的新色譜峰，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致［8］;而d、e和f區(qū)域中，干姜和炮姜的紫外吸收均明顯較生姜強(qiáng)，說(shuō)明在炮制過(guò)程中部分成分的量有所增加。直觀分析結(jié)果可見(jiàn)生、干、炮姜的共有色譜峰差異明顯，表明生姜在干燥和砂燙過(guò)程中，發(fā)生了多種成分的“質(zhì)”與“量”的變化，這為其藥效差異提供了質(zhì)量方面的證據(jù)。

圖4 生、干、炮姜對(duì)照特征圖譜和混合對(duì)照品的UPLC色譜圖Fig.4 Common UPLC chromatogram of 17 batches of samples and mixed reference substunces

3.3 生、干、炮姜的指紋圖譜相似度計(jì)算 本實(shí)驗(yàn)采用中國(guó)藥典委員會(huì)推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》，分別對(duì)不同產(chǎn)地的生、干、炮姜藥材的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同產(chǎn)地生、干、炮姜相似度計(jì)算Tab.2 Similarity evaluation of 17 batches ofsamples

由表2可知，17批生、干、炮姜飲片的指紋圖譜各自的相似度均大于0.9，說(shuō)明不同產(chǎn)地間各批藥材相似性較好，其代表性指紋圖譜的選擇較為合理［7］，生姜、干姜和炮姜的質(zhì)量差異主要是在炮制過(guò)程中產(chǎn)生的。

4 討論

金元時(shí)期著名醫(yī)家李杲曾云“干姜，生辛炮苦，陽(yáng)也，生用逐寒邪而發(fā)表，炮則除胃冷而守中……”，生姜與其炮制品的藥性、藥效既有相似之處，又有較明顯差異，臨床應(yīng)用也有明顯區(qū)別。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，17批不同產(chǎn)地生姜的色譜圖的整體特征相似，說(shuō)明不同產(chǎn)地生姜所含的主要成分類別較一致，但是不同產(chǎn)地姜的指紋圖譜在非共有峰和特征指紋峰的相對(duì)比例、面積上存在一定的差異，說(shuō)明產(chǎn)地對(duì)藥材的成分量有一定影響，這可能與產(chǎn)地、生產(chǎn)年限、采收等因素都有一定的關(guān)系。由生姜、干姜、炮姜的UPLC指紋圖譜可以看出，炮制前后，指紋圖譜色譜峰有明顯的差異，干姜、炮姜與生姜相比差異主要表現(xiàn)在新色譜峰的增加或原色譜峰的缺失及峰面積的改變;干姜與炮姜相比，共有色譜峰也有明顯差異，且炮姜的色譜峰面積較干姜小;由此可以看出，炮制前后，生姜中的成分發(fā)生了“質(zhì)”與“量”兩方面的改變，炮制方法的不同對(duì)姜的成分含有量也具有明顯的影響，這是姜不同炮制品功效和臨床應(yīng)用不同的內(nèi)在依據(jù)。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典:2010年版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:93.

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