半枝蓮中總生物堿的提取及抑菌作用的初步研究

王桂玲， 房建強， 邊書芹， 崔召娟， 趙雪梅

(泰山醫(yī)學院，山東泰安 271000)

半枝蓮為唇形科黃芩屬植物半枝蓮Scutellaria barbataD.Don的干燥全草，別名通經(jīng)草、并頭草、牙刷草、韓信草等，味辛、苦，性寒，具有清熱解毒、散瘀止血之功效。可以用于治療癌癥 (如肝癌、肺癌、乳腺癌、絨毛膜上皮癌等)，咽喉腫痛、疔瘡腫毒、毒蛇咬傷、跌打損傷等癥［1］。半枝蓮作為常用的中藥，含有多種化學成分，主要有黃酮類、二萜類、生物堿類、甾體類、酚類、多糖等［2-3］。目前，對半枝蓮的研究大多數(shù)集中在黃酮類、多糖類等成分的提取、分離、純化，藥理作用方面［4-6］，而對半枝蓮生物堿類成分有關(guān)這些方面的研究很少，本研究首先采用單因素試驗結(jié)合Box-Behnken效應面法，以總生物堿提取量為指標進行試驗，考察乙醇體積分數(shù)、提取時間、料液比、超聲功率、提取次數(shù)等因素對提取工藝的影響，確定了最佳的提取工藝條件，然后采用紙片擴散法考察總生物堿提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌的抑菌作用。本研究可為最大限度開發(fā)半枝蓮藥理作用提供可靠的實驗依據(jù)，同時也為進一步開發(fā)和臨床合理利用半枝蓮中生物堿類成分提供了參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津UV—2550紫外可見分光光度計 (島津國際貿(mào)易上海有限公司);FDU-1200冷凍干燥機 (上海愛朗儀器有限公司);RE—52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海亞榮生化儀器廠);TMQ.R—3250自動臺式滅菌器 (山東新華醫(yī)療器械股份有限公司);KQ—500DE數(shù)控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);SW—CJ—2F超凈工作臺 (蘇州凈化設備有限公司);HHB11電熱恒溫培養(yǎng)箱 (天津市實驗儀器廠)。

1.2 試藥 半枝蓮 (山東菏澤泰山中藥飲片有限公司);鹽酸小檗堿對照品 (上海同田生化技術(shù)有限公司，批號09030522，純度98%);營養(yǎng)瓊脂 (天津市英博生化世紀有限公司);藥敏片 (氟哌酸、阿米卡星、氨芐青霉素等)(北京太洋藥業(yè)有限公司);二甲基亞砜 (天津市凱通化學試劑有限公司);其它試劑均為分析純。

1.3 菌種 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌(由泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科提供)。

2 方法與結(jié)果

2.1 總生物堿定量測定［7-8］

2.1.1 標準品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品1.2 mg，用甲醇-鹽酸 (100∶1)溶液溶解，定容到10 mL量瓶中，搖勻，配成質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL的鹽酸小檗堿對照品溶液，保存，備用。

2.1.2 確定最大吸收波長 精密吸取2.1.1項鹽酸小檗堿對照溶液0.2 mL，置于10 mL比色管中，加甲醇-鹽酸(100∶1)溶液至8 mL，搖勻，在紫外分光光度儀上200～800 nm區(qū)間掃描，確定最大吸收波長為348 nm。

2.1.3 標準曲線的繪制 精密吸取2.1.1項鹽酸小檗堿對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，置于10 mL比色管中，分別加甲醇-鹽酸 (100∶1)溶液至8 mL，搖勻，以甲醇-鹽酸 (100∶1)溶液作空白，在348 nm處測定吸光度，為減少操作誤差平行測定3次，求平均值。得回歸方程:A=69.867C+0.022，R2=0.998 6，表明在0.001 5～0.007 5 mg/mL線性關(guān)系良好。

2.2 總生物堿提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗 分別選取乙醇體積分數(shù)、提取時間、料液比、超聲功率、提取次數(shù)5個因素研究其對總生物堿提取量的影響。

2.2.1.1 乙醇體積分數(shù)對總生物堿提取量的影響 稱取半枝蓮5份，每份1 g，分別用30倍體積的45%、55%、65%、75%、85%的乙醇，70℃，250 W功率，回流提取30 min，提取1次，得到的提取液分別用相應體積分數(shù)的乙醇定容到100 mL量瓶中，再分別用移液管移取2 mL溶液，蒸干，用甲醇-鹽酸 (100∶1)定容到25 mL量瓶中，在348 nm測定。結(jié)果見圖1。從圖中可以看出隨著乙醇體積分數(shù)的提高，總生物堿提取量也隨之增加，但乙醇體積分數(shù)到達55%時出現(xiàn)最高點，此后隨著乙醇體積分數(shù)增加，總生物堿提取量呈下降趨勢。說明半枝蓮中生物堿類成分的極性較大。所以選擇55%乙醇作為提取的適宜溶劑。

圖1 乙醇體積分數(shù)對總生物堿提取量的影響

2.2.1.2 提取時間對總生物堿提取量的影響 稱取半枝蓮5份，每份1 g，70℃，250 W功率，采用30倍體積55%乙醇分別提取20、30、40、50、60 min，提取1次。得到的提取液分別用55%乙醇定容到100 mL量瓶中，再分別用移液管移取2 mL溶液，蒸干，用甲醇-鹽酸 (100∶1)定容到25 mL量瓶中，在348 nm測定。結(jié)果見圖2，從圖中可以看出，隨著時間的延長，總生物堿提取量逐漸增加，當提取時間為50 min時出現(xiàn)一個小高峰，此后提取量略有下降，所以選擇提取時間以50 min為宜。

圖2 提取時間對總生物堿提取量的影響

2.2.1.3 料液比對總生物堿提取量的影響 稱取半枝蓮5份，每份1 g，70℃，250 W功率，采用55%乙醇，料液比分別為 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，回流提取 50 min，得到的提取液分別用55%乙醇定容到100 mL量瓶中，再分別用移液管移取2 mL溶液，蒸干，用甲醇-鹽酸 (100∶1)定容到25 mL量瓶中，在348 nm測定。結(jié)果見圖3，從圖中可以看出，隨著料液比的增加，總生物堿提取量也隨之增加，這是因為溶劑增多則有更多的生物堿溶解于醇中，但料液比達1∶50時出現(xiàn)最高點，此后提取量略呈下降趨勢，所以選擇料液比1∶50左右為宜。

圖3 料液比對總生物堿提取量的影響

2.2.1.4 超聲功率對總生物堿提取量的影響 稱取半枝蓮5份，每份1 g，70℃，料液比1∶50，分別采用250、300、350、400、450 W的功率，回流提取50 min，得到的提取液分別用55%乙醇定容到100 mL量瓶中，再分別用移液管移取2 mL溶液，蒸干，用甲醇-鹽酸 (100∶1)定容到25 mL量瓶中，在348 nm測定。結(jié)果見圖4，從圖中可以看出，隨著功率的增加，總生物堿提取量先隨之下降，然后隨之升高，但功率達350 W時出現(xiàn)一個小高峰，此后隨著功率繼續(xù)增加，提取量呈下降趨勢，故功率選擇350 W為宜。

圖4 超聲功率對總生物堿提取量的影響

2.2.1.5 提取次數(shù)對總生物堿提取量的影響 稱取半枝蓮5份，每份1 g，70℃，料液比1∶50，功率為350 W，回流提取50 min，分別提取1次、2次、3次。得到的提取液分別用55%乙醇定容到100 mL量瓶中，再分別用移液管移取2 mL溶液，蒸干，用甲醇-鹽酸 (100∶1)定容到25 mL量瓶中，在348 nm測定。結(jié)果見圖5，從圖中可以看出，隨著提取次數(shù)的增加，提取量逐漸增加，提取次數(shù)為由2次到3次時，總生物堿提取量增加的幅度不大，說明總生物堿已提取完全。所以從節(jié)省能源，降低成本考慮，提取次數(shù)選2次為宜。

圖5 提取次數(shù)對總生物堿提取量的影響

2.2.2 Box-Behnken效應面法優(yōu)化總生物堿提取工藝

2.2.2.1 實驗設計及結(jié)果 根據(jù)Design-Expert 8.05b軟件中Box-Behnken設計原理，綜合單因素試驗結(jié)果，選取乙醇體積分數(shù)、提取時間和料液比對總生物堿提取量有顯著影響的3個因素，每因素設3水平，用代碼－1、0、+1表示，代碼值所代表的物理量見表1，實驗設計及結(jié)果見表2。

表1 因素水平

表2 實驗設計及結(jié)果

2.2.2.2 模型的建立 用ANOVA分析效應面的回歸參數(shù)，分析結(jié)果見表3。由表3可知，乙醇體積分數(shù)、提取時間1次項、乙醇體積分數(shù)、提取時間2次項達到極顯著水平(P＜0.01)，乙醇體積分數(shù)和提取時間交互作用達到顯著水平 (P＜0.05)。Design-Expert 8.05b軟件對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得總生物堿提取量對乙醇體積分數(shù) (A)、提取時間 (B)、料液比 (C)的2次回歸模型:Y=13.25－0.9A+1.65B－0.2C+0.81AB+0.25AC+0.3BC－1.35A2－1.25B2－0.14C2，該方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.949 5。再由表3可知，整體模型達到極顯著水平 (P＜0.01)，表明該二次方程模型比較顯著，失擬項不顯著 (P=0.050 2)。該方程對試驗擬合較好，可以對不同條件下的總生物堿提取量進行預測。

表3 回歸分析結(jié)果

2.2.2.3 提取工藝的響應面分析及優(yōu)化 采用Design-Expert8.05b軟件，根據(jù)回歸方程分析結(jié)果，作出相應的響應面圖，見圖6～8。圖6顯示，料液比為1∶50的條件下，乙醇體積分數(shù)與提取時間對總生物堿提取量的影響，乙醇體積分數(shù)和提取時間的影響基本呈二次關(guān)系，總生物堿提取量隨著提取時間增加逐漸增加，當乙醇體積分數(shù)為52%左右時，總生物堿提取量達到最大值。

圖6 提取時間與乙醇體積分數(shù)對總生物堿提取量影響的響應面

圖7顯示，提取時間為50 min條件下，乙醇體積分數(shù)與料液比對總生物堿提取量的影響，料液比基本上對總生物堿提取量影響不大，乙醇體積分數(shù)對總生物堿提取量的影響呈二次關(guān)系，呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。

圖7 料液比與乙醇體積分數(shù)對總生物堿提取量影響的響應面

圖8顯示，乙醇體積分數(shù)為55%的條件下，提取時間與料液比對總生物堿提取量的影響，提取時間影響基本呈二次關(guān)系，提取時間在58 min左右時，總生物堿提取量達到最大值。

圖8 提取時間與料液比對總生物堿提取量影響的響應面

2.2.2.4 總生物堿提取的工藝條件 根據(jù)模型的分析結(jié)果，結(jié)合對總生物堿提取量有影響的各因素變化的響應面圖，確定總生物堿提取的最佳工藝條件為:乙醇體積分數(shù)為52.17%，提取時間為58.51 min，料液比為1∶45.87，在此條件下總生物堿理論提取量為13.829 7 mg。

2.2.2.5 驗證試驗 在此最佳工藝條件下進行提取總生物堿平均提取量為13.306 5 mg，與理論提取量接近，說明該模型可靠。

2.3 總生物堿抑菌實驗研究

2.3.1 總生物堿溶液的制備 稱取半枝蓮50 g，按最佳工藝條件進行提取，提取液回收乙醇后用1/2體積的石油醚萃取2次，萃取后凍干，制成總生物堿粗粉。稱取總生物堿粗粉142.5 mg(相當于生物堿12.6 mg)，用700 μL的DMSO溶解，制成質(zhì)量濃度為18.0 mg/mL的溶液，備用。

2.3.2 紙片擴散法測定總生物堿的抑菌作用 將定性濾紙用打孔器打成直徑為6 mm的紙片，高壓滅菌后烘干。然后將濾紙片用無菌鑷子夾取放入總生物堿粗提物溶液中浸泡，用涂抹法將各供試菌液 (菌液濃度約為107～108cfu/mL)接種在培養(yǎng)基上，再用無菌鑷子夾取沾有總生物堿溶液的濾紙片放入培養(yǎng)皿中，藥敏片做陽性對照，DMSO浸潤的濾紙片作陰性對照［9-10］。然后放入37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈的直徑，并記錄測量數(shù)據(jù)，每組實驗重復3次。判斷標準:抑菌圈直徑大于6 mm者判為有抑菌作用;抑菌圈直徑小于或等于6 mm者判為無抑菌作用;3次重復試驗均達到有抑菌作用結(jié)果者判為合格。陰性對照組應無抑菌圈產(chǎn)生，否則實驗無效。結(jié)果見表4、5及圖9所示，從表4、5數(shù)據(jù)及圖9可以看出，半枝蓮總生物堿粗提物質(zhì)量濃度為18.0 mg/mL時對金黃色葡萄球菌無論是標準株還是耐藥株都有一定的抑菌作用，屬于中度敏感，但對大腸桿菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌沒用抑菌作用。

表4 半枝蓮總生物堿的抑菌作用

表5 半枝蓮總生物堿抑菌定性實驗結(jié)果

圖9 總生物堿粗提物抑制金黃色葡萄球菌的效果照片

3 討論

3.1 在中藥提取、制劑工藝篩選過程中，常常需同時考察多個因素對結(jié)果的影響，并對結(jié)果進行優(yōu)化確定最佳條件。國內(nèi)現(xiàn)在用得比較成熟的方法有正交試驗設計和均勻設計，這兩種設計方法試驗次數(shù)較少，操作簡便，但不能靈敏地考察各因素之間的交互作用。Box-Behnken效應面法是一種新型的試驗設計方法，能在給出的區(qū)域上找到因素和響應值之間的一個明確的函數(shù)表達式，從而找到整個區(qū)域上因素的最佳組合和響應值的最優(yōu)值，并且能研究幾種因素間交互作用的分析方法，具有試驗次數(shù)少，精度高等優(yōu)點，在國內(nèi)外藥學領域已經(jīng)得到了廣泛的應用［11-13］。

3.2 本研究曾采用酸水超聲提取半枝蓮中生物堿類成分［14］，通過與乙醇提取進行比較，發(fā)現(xiàn)酸水超聲提取的生物堿量雖然較高，但同時會提取出一些水溶性的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖等成分，這些雜質(zhì)會使后續(xù)處理如堿化、過濾等環(huán)節(jié)變得繁瑣，另外酸、堿還會對儀器設備產(chǎn)生腐蝕，所以采用乙醇超聲提取半枝蓮中的生物堿。

3.3 本研究以總生物堿提取量為指標，在單因素試驗的基礎上，利用Box-Behnken效應面法確定了半枝蓮總生物堿提取的最佳的工藝參數(shù)，總生物堿提取的最佳工藝條件為加45.87倍52.17%的乙醇，提取2次，每次為58.51 min，此最佳工藝條件下進行驗證試驗，驗證試驗總生物堿平均提取量為13.306 5 mg，與理論值接近，說明Box-Behnken效應面法應用在中藥提取工藝篩選的可行性。

3.4 通過對總生物堿粗提物進行體外抑菌作用研究，表明質(zhì)量濃度為18.0 mg/mL半枝蓮總生物堿對金黃色葡萄球菌無論是標準株還是耐藥株都有一定的抑菌作用，但對大腸桿菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌沒用抑菌作用。通過研究發(fā)現(xiàn)總生物堿主要抑菌對象是革蘭氏陽性菌，特別是對金黃色葡萄球菌的抑菌作用較強，因此，推測總生物堿的抑菌成分作用部位可能在細菌的細胞壁上，但具體的作用機制還有待進一步研究。

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