毛細管電泳法測定歐亞旋覆花中蘆丁、山柰酚和綠原酸

馮海燕， 李向軍， 雷 霓， 張 林

(1.石家莊學院化工學院，河北石家莊 050035;2.中國科學院大學化學與化學工程學院，北京 100049)

歐亞旋覆花為菊科旋覆花屬植物歐亞旋覆花Inula britannicaL.的干燥頭狀花序，是一種傳統(tǒng)中藥，具有降氣止嘔，消痰行水之功效，主治咳嗽消痰、脅下脹滿、大腹水腫、泄散風寒等癥［1-2］。研究表明，歐亞旋覆花黃酮具有良好的抗氧化活性［3-6］，是其發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎;綠原酸因具有抗菌消炎、增強機體免疫的作用［7］，也為歐亞旋覆花的一種有效成分。

關于歐亞旋覆花中黃酮類成分和綠原酸的檢測，主要采用 HPLC法［7-9］。高效毛細管電泳(HPCE)以其高效、快速、低耗的特點，已廣泛應用于中藥活性成分的檢測［10］。本實驗采用HPCE法，對歐亞旋覆花中兩種黃酮類成分 (蘆丁和山柰酚)進行了測定，并同時對綠原酸的量進行分析。

1 儀器與試劑

CL1030高效毛細管電泳儀 (北京彩陸科學儀器有限公司);熔融石英毛細管 (50 cm ×50 μm，有效長度為42 cm，河北永年光導纖維廠);DELTA 320 pH計［梅特勒—托利多儀器 (上海)有限公司］;KQ—250DE數(shù)控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);S2—93自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠);RE—52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

蘆丁、山柰酚、綠原酸對照品均購于中國藥品生物制品檢定所 (批號分別為:100080-200707，110861-200808和110753-200413);歐亞旋覆花購于河北安國、山西、河南，經(jīng)本學院生藥教研室岳紅坤副教授鑒定。其他化學試劑皆為分析純，實驗用水為重蒸水。

2 實驗方法

2.1 溶液配制

2.1.1 對照品溶液 精密稱取蘆丁、山柰酚、綠原酸適量，分別加甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，得質(zhì)量濃度為3.2 mg/mL蘆丁，2.0 mg/mL山柰酚和2.1 mg/mL綠原酸貯備液，冰箱中保存。使用前用甲醇適當稀釋。

2.1.2 供試品溶液 取歐亞旋覆花1.0 g，精密稱定，加入200 mL水，在功率200 W，提取溫度60℃的條件下超聲提取45 min，濾過，定容于250 mL量瓶中。吸取提取液50 mL，減壓濃縮，至終體積為25 mL，即得供試品溶液。

2.2 電泳條件 運行緩沖液為10 mmol/L硼砂溶液 (pH 9.5);重力進樣10 cm，13 s;分離電壓23 kV;檢測波長254 nm。毛細管柱在第一次使用前依次用甲醇、重蒸水、1 mol/L氫氧化鈉溶液、重蒸水和運行緩沖液各沖洗10 min，每次電泳后以重蒸水、0.1 mol/L氫氧化鈉溶液、重蒸水和運行緩沖溶液依次沖洗2、3、4、5 min。樣品溶液和緩沖溶液使用前需經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾并超聲脫氣。

3 結(jié)果與討論

3.1 電泳條件優(yōu)化

3.1.1 緩沖液組成和濃度 蘆丁和綠原酸含有鄰二羥基，山柰酚含有間二羥基，均可與硼砂復合成帶電粒子［11］，從而改善分離效果，故實驗以硼砂體系作為緩沖溶液。預實驗發(fā)現(xiàn)，蘆丁和山柰酚的出峰時間比較接近，而與綠原酸的出峰時間相差較遠，故實驗主要考察硼砂濃度對蘆丁和山柰酚遷移時間的影響。硼砂濃度較低時，山柰酚與蘆丁間的分離度隨硼砂濃度的改變無明顯變化 (圖1A);當濃度高于10 mmol/L時，隨硼砂濃度的增加兩者的分離度變差，當硼砂濃度為20 mmol/L時，兩譜峰完全重疊;再增加硼砂的濃度，蘆丁和山柰酚的出峰順序發(fā)生翻轉(zhuǎn)，兩者間的分離效果逐漸變好?？紤]到硼砂濃度較高，會引起工作電流的升高，焦耳熱的增加及出峰時間的延長，實驗選擇10 mmol/L的硼砂緩沖溶液。

3.1.2 緩沖液pH pH能影響zeta電勢、電滲流(EOF)和分析物的帶電情況，進而影響分析物的遷移時間和分離效果。當pH為9.0時，蘆丁和山柰酚兩組分的電泳譜峰完全重疊;繼續(xù)升高緩沖液pH，二者間的分離程度加大。當緩沖液pH為9.5時，既能保證蘆丁和山柰酚間的良好分離，又能使整個分析時間較短 (圖1B)，故實驗選擇pH 9.5的硼砂緩沖溶液。

圖1 緩沖液濃度 (A)和pH(B)對出峰時間的影響Fig.1 Effects of the concentration(A)and pH(B)of the buffer solution on the migration time

3.1.3 工作電壓 試驗對工作電壓從14～29 kV每隔3個單位進行考察，發(fā)現(xiàn)隨工作電壓的升高，遷移時間縮短，但分離度變差。在工作電壓為23 kV時，3組分可得到較好分離，且遷移時間及峰高適中，故實驗選擇23 kV為工作電壓。

3.1.4 進樣時間 固定緩沖液濃度、pH及分離電壓，在進樣高度10 cm的前提下，調(diào)節(jié)進樣時間依次為3、7、9、11、13和15 s，考察進樣時間對分析物峰高的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):隨進樣時間的增加，峰高逐漸增大，但在13 s以后峰高變化不再明顯，且峰形加寬，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，實驗選擇13 s為最佳進樣時間。

3.2 提取條件優(yōu)化

3.2.1 提取方法 選擇超聲波提取法提取歐亞旋覆花中的活性成分，考察了不同提取溶劑 (水、50%乙醇、無水乙醇)對3種活性成分提取率的影響。結(jié)果表明，以水為溶劑3種成分總含有量最高，且安全無毒，操作方便，故實驗以水做提取溶劑。

3.2.2 提取條件 選擇固液比、提取溫度、提取時間3個因素，每個因素選擇3個水平，設定因素水平表，進行正交實驗，確定2.1項下提取條件。

3.3 線性方程和檢出限 取對照品貯備溶液，逐級稀釋成一系列質(zhì)量濃度的對照品溶液，在優(yōu)化的條件下進樣 (譜圖見圖2A)。以蘆丁、山柰酚、綠原酸的質(zhì)量濃度X(μg/mL)為橫坐標，峰高Y為縱坐標，得到線性回歸方程，按信噪比為3計算最低檢出限，實驗結(jié)果參見表1。

圖2 混合對照品 (A)和樣品 (B)的電泳圖Fig.2 Electropherograms of mixed reference substances(A)and the samples(B)

表1 回歸方程和檢出限Tab.1 Regression equations and detection limits

3.4 精密度試驗 按試驗條件以質(zhì)量濃度均為75 μg/mL的混合標準溶液考察所建實驗方法的重現(xiàn)性，連續(xù)進樣5次，蘆丁、山柰酚、綠原酸遷移時間的RSD分別為0.41%、0.66%和0.34%，峰高的RSD分別為2.01%、1.75%、1.45%。

3.5 穩(wěn)定性試驗 取河北產(chǎn)歐亞旋覆花供試品溶液，按2.2項下電泳條件分別在0、0.5、1、2、4、6 h測定蘆丁、山柰酚、綠原酸峰高，其RSD分別為1.82%、1.23%和1.69%，說明常溫下6 h內(nèi)，供試品溶液保持穩(wěn)定。

3.6 重復性試驗 取同一批歐亞旋覆花藥材樣品，平行制備供試品溶液5份，分別進行毛細管電泳分析。測得樣品中蘆丁、山柰酚和綠原酸的含有量，RSD分別為2.24%、1.94%和1.70%，說明該測定方法重復性較好。

3.7 回收率試驗 精密稱取已知含有量的樣品粉末0.5 g，加入質(zhì)量濃度分別為0.4、1.0、0.2 mg/mL的蘆丁、山柰酚和綠原酸對照品溶液0.50、0.60和0.50 mL，按2.1項下提取、定容、測定，計算加樣回收率和RSD，實驗結(jié)果列于表2。

表2 回收試驗結(jié)果 (n=6)Tab.2 Results of recovery tests(n=6)

3.8 樣品測定 取不同產(chǎn)地的歐亞旋覆花藥材樣品，按2.1項下操作制備供試品溶液，按2.2項下電泳條件進樣分析。采用外標法計算含有量，結(jié)果見表3，電泳圖見圖2B。不難看出，不同產(chǎn)地的歐亞旋覆花中蘆丁、山柰酚、綠原酸的量有所不同，其中山西產(chǎn)歐亞旋覆花中3種成分的總量最高，這可能與藥材的品種基因、生長環(huán)境和貯存條件等因素有關;3種來源的歐亞旋覆花中山柰酚的量普遍較高，明顯高于另外兩種成分，在0.92～1.73 mg/g之間，有可能是歐亞旋覆花的主要活性成分［9］，其分析方法的建立就顯得尤為重要。

4 小結(jié)

毛細管電泳法測定歐亞旋覆花中蘆丁、山柰酚和綠原酸具有快速 (＜6 min)、準確、微量的優(yōu)點。實驗結(jié)果表明，不同產(chǎn)地歐亞旋覆花藥材中3種成分的量有所差異，山柰酚可能是歐亞旋覆花中主要的活性成分，測定其含有量對歐亞旋覆花的質(zhì)量控制具有重要意義。本方法的建立為全面評價歐亞旋覆花及其相關藥物的質(zhì)量提供了一種簡便可靠的分析方法。

表3 不同產(chǎn)地歐亞旋覆花中 3種分析物的測定結(jié)果(n=5)Tab.3 Contents of three constituents in Inula britannica L.from different habitats(n=5)

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