貼敷后祖師麻膏藥中祖師麻甲素和7-羥基香豆素的殘留量測(cè)定

李 爽， 石曉峰，*， 范 彬， 白朝輝

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730030;2.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，甘肅蘭州 730050)

祖師麻膏藥 (國(guó)藥準(zhǔn)字Z62020522)為國(guó)家中藥保護(hù)品種，收載于《部頒標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十八冊(cè)》(標(biāo)準(zhǔn)號(hào):WS3-B-3456-98)，由祖師麻提取精制的浸膏粉和武威膏藥組成［1］。主藥祖師麻藥材含有香豆素類、二萜類、木質(zhì)素類、黃酮類、蒽醌類及甾醇類等化學(xué)成分［2-3］。有關(guān)采用高效液相色譜法 (HPLC)研究祖師麻藥材指紋圖譜［4-5］及其主要有效成分祖師麻甲素 (7，8-二羥基香豆素，又稱瑞香素，Daphnetin)、7-羥基香豆素 (傘形酮，又稱傘形花內(nèi)酯，7-Hydroxycoumarin)、紫丁香苷 (syringin)定量測(cè)定的方法已有文獻(xiàn)報(bào)道［6-10］，對(duì)祖師麻膏藥中祖師麻甲素和紫丁香苷測(cè)定的HPLC法也有文獻(xiàn)報(bào)道［11-12］。為了評(píng)價(jià)祖師麻膏藥的透皮吸收效果，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法，建立了同時(shí)測(cè)定祖師麻膏藥中祖師麻甲素和7-羥基香豆素的方法，并通過對(duì)祖師麻膏藥貼敷前后祖師麻甲素和7-羥基香豆素的測(cè)定，考察貼敷后祖師麻膏藥的藥物殘留率，希冀為祖師麻膏藥的使用和二次開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent1120型高效液相色譜儀 (美國(guó)安捷倫公司);AE260型萬分之一電子天平 (瑞士Mettle Toledo公司);CP225D型十萬分之一電子分析天平 (德國(guó)Sartorius公司);SHZ-D型循環(huán)水式真空泵(河南鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);SK3310HLC型超聲波清洗器 (上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司);766型遠(yuǎn)紅外快速干燥箱 (江蘇省南通縣金余電器配件廠)。

1.2 試藥

祖師 麻 膏 藥 (10 g/張，批 號(hào):20090809、20111118)由甘肅泰康制藥有限責(zé)任公司提供;對(duì)照品祖師麻甲素 (供定量測(cè)定用，批號(hào):110900-200405)、7-羥基香豆素 (供定量測(cè)定用，批號(hào):111739-200501)均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供;甲醇 (色譜純，批號(hào):20110627012)、乙腈(色譜純，批號(hào):2010100102)均由西隴化工股份公司提供;水為重蒸水;其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取祖師麻甲素對(duì)照品4.20 mg和7-羥基香豆素對(duì)照品2.50 mg，各置25 mL量瓶中，加40%乙醇溶解并定容，分別配制成每1 mL含祖師麻甲素0.168 mg、7-羥基香豆素0.100 mg的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 除去背襯刮取膏藥上的藥物，精密稱取0.5 g，置50 mL圓底燒瓶中，加入40%乙醇10 mL，稱定質(zhì)量，回流提取1 h，放置室溫后稱定質(zhì)量，用40%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，過濾。濾渣加入40%乙醇10 mL，稱定質(zhì)量，回流提取1 h，放置室溫后用40%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，過濾，濾渣再加入40%乙醇2 mL沖洗，合并濾液和沖洗液，蒸干，殘?jiān)?0%乙醇溶解并定容至10 mL量瓶中，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備 按祖師麻膏藥生產(chǎn)工藝制備不含祖師麻浸膏粉的樣品，依2.1.2項(xiàng)下操作制成陰性對(duì)照溶液。

2.2 香豆素成分測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Agilent E-clipse Plus C18色 譜 柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈 －0.1%磷酸水溶液(15∶85);體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm;柱溫30℃;進(jìn)樣量20 μL。分別精密吸取上述溶液各20 μL，注入液相色譜儀，依上述優(yōu)化色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果樣品中祖師麻甲素、7-羥基香豆素均得到較好分離，與其相鄰色譜峰分離度大于1.5。理論塔板數(shù)以祖師麻甲素和7-羥基香豆素峰面積計(jì)算不得低于3 000。見圖1。

圖1 對(duì)照品 (A)，陰性樣品 (B)和供試品 (C)的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)，negative sample(B)and sample(C)

2.2.2 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取祖師麻甲素對(duì)照品溶液 100、150、200、250、300、350、400 μL和7-羥基香豆素對(duì)照品溶液50、100、200、300、400、500、600 μL至1 mL量瓶中，用40%乙醇稀釋至刻度搖勻，制得系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。精密吸取上述對(duì)照品溶液各20 μL，依次進(jìn)樣測(cè)定峰面積。以質(zhì)量濃度 (Y，μg/mL)為縱坐標(biāo)，峰面積 (X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

祖師麻甲素回歸方程:Y=1.126 48×10－6X－0.036 11(r=0.999 1)，線性范圍 16.8～67.2 μg/mL。7-羥基香豆素回歸方程:Y=7.595 17×10－7X－1.663 73(r=0.999 1)，線性范圍5～60 μg/mL。

結(jié)果表明，祖師麻甲素和7-羥基香豆素在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積的積分值呈良好線性關(guān)系。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取祖師麻甲素對(duì)照品溶液 300 μL、7-羥基香豆素對(duì)照品溶液 400 μL，于1 mL量瓶中，加40%乙醇稀釋至刻度，搖勻，配制成祖師麻甲素、7-羥基香豆素質(zhì)量濃度分別為50.4 μg/mL、40 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。精密吸取該對(duì)照品溶液20 μL，按上述液相色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果祖師麻甲素、7-羥基香豆素峰面積積分值的RSD分別為1.33%和1.25%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取樣品0.5 g(批號(hào):20090810)，按2.1.2項(xiàng)下操作制得供試品溶液，依上述色譜條件，于 0、2、4、6、8、10、12、24 h分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積，求得祖師麻甲素、7-羥基香豆素峰面積積分值的 RSD分別為2.58%和2.10%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批祖師麻膏藥0.5 g(批號(hào):20090810)，共6份，按2.1.3項(xiàng)下操作制得供試品溶液，按上述色譜條件，進(jìn)樣20 μL測(cè)得祖師麻甲素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)和RSD分別為0.691 0 mg/g和1.51%，7-羥基香豆素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)和RSD分別為0.677 0 mg/g和1.48%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性較好。

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知量 (批號(hào):20090810)樣品約0.3 g，共9份，按樣品含有量的80%、100%和120%分別加入祖師麻甲素和7-羥基香豆素對(duì)照品溶液，按2.1.2項(xiàng)下操作制得供試品溶液，依上述色譜條件下進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算結(jié)果見表1，祖師麻甲素和7-羥基香豆素的平均加樣回收率分別為100.58%(RSD=1.62%)和100.53%(RSD=1.74%)。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Tab.1 Results of recovery test(n=3)

2.3 貼敷后祖師麻膏藥中祖師麻甲素、7-羥基香豆素的殘留量測(cè)定

6名健康志愿者，簽署知情同意書后分別在背部貼敷祖師麻膏藥 (批號(hào):20111118，祖師麻甲素和7-羥基香豆素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.217 8 mg/g、0.738 4 mg/g)3貼，于24、48、72 h各揭帖1張，編號(hào)后，除去背襯刮取膏藥上的藥物，撕碎，備用。按2.1.2項(xiàng)下操作制得供試品溶液，按上述色譜條件下，進(jìn)樣20 μL測(cè)定峰面積，計(jì)算祖師麻膏藥貼敷不同時(shí)間后祖師麻甲素、7-羥基香豆素的殘留量。依下列公式計(jì)算祖師麻膏藥貼敷后祖師麻甲素、7-羥基香豆素的殘留率，結(jié)果見表2。

由表2可知，貼敷24、48、72 h后的祖師麻膏藥中祖師麻甲素和7-羥基香豆素的平均殘留率分別為 69.45%、53.12%、30.00%和 93.23%、88.28%、86.74%。

表2 祖師麻膏藥貼敷不同時(shí)間后祖師麻甲素和7-羥基香豆素的殘留量和殘留率Tab.2 Residual amount and residual rate of daphnetin and 7-hydroxycoumarin in Zushima Plaster used for different time

3 討論

選用文獻(xiàn)報(bào)道的流動(dòng)相如甲醇－0.5%醋酸水溶液 (25 ∶75)［6］、甲醇 －0.5% 磷酸水溶液(20 ∶80)［7］、乙 腈-水 (30 ∶70)［8］、 乙 腈-水(8∶92)［11］分別考察祖師麻甲素和7-羥基香豆素的分離效果與色譜峰對(duì)稱性，結(jié)果均不理想。而采用乙腈－0.1%磷酸水溶液 (15∶85)為流動(dòng)相，祖師麻甲素、7-羥基香豆素的色譜峰的對(duì)稱性和分離度均較好，達(dá)到理想的分離效果。

分別選用水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、無水乙醇作為提取溶劑對(duì)祖師麻膏藥進(jìn)行回流提取，以祖師麻甲素、7-羥基香豆素的提取率為考察指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)40%乙醇作為提取溶劑提取效率較高，故以其為提取溶劑。

文獻(xiàn)［13］報(bào)道，祖師麻膏藥貼于人體使用24 h后，藥布上殘留的香豆素類成分占使用前的90%左右，貼48 h后有效成分仍殘留80%，表明膏藥中部分有效成分未被吸收。但是實(shí)驗(yàn)中測(cè)得6名志愿者貼敷24、48、72 h后的祖師麻膏藥中祖師麻甲素和7-羥基香豆素的平均殘留率分別為69.45%、53.12%、30.00%和93.23%、88.28%、86.74%，說明祖師麻膏藥中主要有效成分香豆素類的透皮吸收率存在明顯差異，這可能與其化學(xué)結(jié)構(gòu)中的羥基數(shù)量有關(guān)。

由于使用后祖師麻膏藥有效成分的殘留較多，使用時(shí)可反復(fù)揭貼使用多次?？紤]到使用后祖師麻膏藥中有效成分香豆素類的殘留較高，可添加適當(dāng)?shù)耐钙ご龠M(jìn)劑使其發(fā)揮更大的藥效。

［1］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)(中藥):中藥成方制劑第十八冊(cè)［S］.

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