丙戊酸鈉對(duì)利福平依賴結(jié)核菌的抑制作用

董 梅，王 迪，楊彩娥，孟祥紅，雷 紅，何菊芳，匡鐵吉

解放軍第309醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京 100091

某些結(jié)核分枝桿菌臨床分離株在一定濃度的利福平作用下，不僅不會(huì)被抑制，反而生長得更快、更旺或更多，這被稱為利福平依賴現(xiàn)象[1-3]。曾有研究表明，藥物依賴現(xiàn)象在體外原代培養(yǎng)時(shí)較為突出，而傳代后卻不穩(wěn)定，即使在含利福平的培養(yǎng)基上傳代，其依賴性也迅速減弱，甚至完全消失。這提示，表觀遺傳機(jī)制在藥物依賴結(jié)核菌中起著重要的作用，針對(duì)表觀遺傳途徑的抑制劑，可能成為抗利福平依賴性結(jié)核的特效藥物。我們近期研究發(fā)現(xiàn)，組氨酸乙?；种苿┍焖徕c(valproate acid sodium，VPA)，在培養(yǎng)基水平對(duì)利福平依賴現(xiàn)象起明顯抑制作用。本研究組曾建立了穩(wěn)定的利福平依賴結(jié)核病小鼠模型，為進(jìn)一步研究提供了參考依據(jù)。本文旨在通過利福平依賴結(jié)核病小鼠模型，研究丙戊酸鈉在體內(nèi)對(duì)利福平依賴結(jié)核菌的作用，為臨床抗結(jié)核提供新的思路和方法。

材料和方法

1 菌株 結(jié)核分枝桿菌利福平依賴株及耐藥株分離于解放軍第309醫(yī)院結(jié)核病研究所病人痰標(biāo)本并經(jīng)多重PCR鑒定為人型結(jié)核分枝桿菌；標(biāo)準(zhǔn)菌株來自于北京結(jié)核病防治所。將原代各菌株轉(zhuǎn)種，收集第三代斜面生長物備用。

2 試藥和試劑 利福平膠囊購自成都錦華藥業(yè)有限公司；丙戊酸鈉購自湖南省湘中制藥有限公司；瓊脂粉、可溶性淀粉、氫氧化鈉均為國產(chǎn)分析純；小牛血清購自浙江金華清湖犢牛利用研究所?？锸吓囵B(yǎng)基由本室自制，具體操作詳見早先報(bào)道[4]。

3 動(dòng)物及分組 SPF級(jí)近交系BALB/c小鼠6~8周，體質(zhì)量16~19 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCYK(京)2002-0003。將雌性小鼠分成四大組，每組32只，分別為攻毒依賴株組、耐藥株組、標(biāo)準(zhǔn)株組小鼠及陰性對(duì)照組；對(duì)于每一大組，按照利福平治療組、VPA治療組、VPA與利福平聯(lián)合治療組、不治療組分為四組，每組8只小鼠。將菌株分別配制成1×106CFU/ml，每只取0.2 ml小鼠尾靜脈注射，對(duì)照組注入等體積的氯化鈉溶液。利福平與VPA每周給藥2次，劑量分別為：利福平1.3 mg/只小鼠；VPA 10 mg/只小鼠。每天觀察小鼠生理狀況。

4 肺組織荷菌量與依賴性測定 于第6周稱重后處死全部小鼠，無菌條件下解剖，取小鼠左肺至無菌研磨器內(nèi)加一定量氯化鈉溶液磨至勻漿，做10倍系列稀釋，各組取 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀釋度，接種于不含藥匡氏培養(yǎng)基和含利福平的匡氏培養(yǎng)基各3支斜面，36.5℃培養(yǎng)，每周觀察依賴性，3周后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SAS8.1軟件對(duì)肺荷菌量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，肺荷菌量取對(duì)數(shù)值進(jìn)行變量變換，定量資料采用析因設(shè)計(jì)定量資料的方差分析。

表2 實(shí)驗(yàn)小鼠感染6周后肺臟荷菌量計(jì)數(shù)Tab.2 Tubercle bacilli load in lung tissues of mice 6 weeks after experimental infection(log10CFU,

表2 實(shí)驗(yàn)小鼠感染6周后肺臟荷菌量計(jì)數(shù)Tab.2 Tubercle bacilli load in lung tissues of mice 6 weeks after experimental infection(log10CFU,

aP＜0.05, vs RFP(+)VPA(-)(resistant strains) group; bP＜0.05, vs RFP(-)VPA(-)(dependent strains) group; cP＜0.05, vs RFP(+)VPA(-)(dependent strains) group

?

結(jié) 果

1 依賴結(jié)核菌小鼠的肺、脾臟器稱重 不治療的情況下，依賴株、耐藥株及標(biāo)準(zhǔn)菌株感染組間脾、肺重量無明顯差異；在利福平治療的情況下，依賴株感染組肺、脾重量明顯高于耐藥株及標(biāo)準(zhǔn)株(P＜0.05)。對(duì)于依賴株，利福平治療組肺、脾重量顯著高于不治療組(P＜0.05)，而耐藥結(jié)核菌中未觀察到同樣現(xiàn)象。見表1。

2 小鼠的肺臟荷菌量 在不治療的情況下，依賴株、耐藥株及標(biāo)準(zhǔn)株感染后，組織荷菌量無明顯差異；在利福平治療的情況下，依賴株感染組菌量明顯高于耐藥株及標(biāo)準(zhǔn)株(P＜0.05)。對(duì)于依賴株，利福平治療組菌量明顯高于不治療組(P＜0.05)，體現(xiàn)出菌株對(duì)利福平的依賴性；VPA與利福平聯(lián)合治療可有效降低肺部結(jié)核菌量(P＜0.05)，而單獨(dú)VPA治療對(duì)結(jié)核菌量并無明顯改變(表2)。說明VPA可以抑制結(jié)核菌對(duì)利福平的依賴性，對(duì)于耐藥結(jié)核菌及標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核菌株，VPA并不能影響結(jié)核菌數(shù)量的改變。見表2。

表1 實(shí)驗(yàn)小鼠感染6周后肺、脾稱重Tab.1 Lung and spleen weight of mice 6 weeks after experimental infection(g,)

表1 實(shí)驗(yàn)小鼠感染6周后肺、脾稱重Tab.1 Lung and spleen weight of mice 6 weeks after experimental infection(g,)

aP＜0.05, vs RFP(-)VPA(-)(dependent strains) group; bP＜0.05, vs RFP(-)VPA(-)(dependent strains) group

?

討 論

上世紀(jì)90年代初，本研究組在臨床結(jié)核菌實(shí)驗(yàn)檢測和生理學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)：很多臨床分離到的結(jié)核菌株，對(duì)常用抗癆藥物異煙肼、鏈霉素和利福平等存在生理性藥物依賴性，其主要特點(diǎn)是：在相當(dāng)大的藥物濃度范圍內(nèi)結(jié)核菌在含藥環(huán)境中生長得更快、更旺和更多。這種藥物依賴性在體外原代培養(yǎng)時(shí)尤為突出。結(jié)核菌這種藥物依賴性不是遺傳性的，雖然表型呈耐藥性，然而相關(guān)基因不存在突變。這可能是眾多耐藥基因檢測陰性耐藥株存在的原因。我國學(xué)者鐘敏等[5]、林紅巖[6]等從2000年起，對(duì)利福平賴藥結(jié)核菌的臨床表象及生物學(xué)特征進(jìn)行了較詳細(xì)的研究，證明結(jié)核菌利福平賴藥性客觀存在，其對(duì)利福平的依賴是相對(duì)依賴，并明確利福平依賴肺結(jié)核以病情重、耐多藥、化療效果差和預(yù)后不良為主要臨床特征。本課題組近期建立了穩(wěn)定的依賴結(jié)核菌株感染的BALB/c小鼠模型，發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌依賴性在體內(nèi)可以長期存在，這使進(jìn)一步研究其作用機(jī)制和治療方法成為可能[7]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙酰化調(diào)控作為一種重要的表觀遺傳修飾，通過調(diào)節(jié)組蛋白乙酰化酶和組蛋白去乙?；钢g的動(dòng)態(tài)平衡，參與了許多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。國際上曾有報(bào)道說：人體癌細(xì)胞藥物依賴現(xiàn)象為表觀遺傳調(diào)控[7-8]，但國際上尚未見到病原菌表觀遺傳研究報(bào)道[9-10]。VPA近期被證實(shí)是組蛋白脫乙酰酶特異性抑制劑之一，是研究表觀遺傳學(xué)作用的重要探針。本研究發(fā)現(xiàn)，利福平治療組依賴株感染結(jié)核菌量遠(yuǎn)大于不治療組(6.27±0.88 vs 4.79±0.62，P＜0.05)，與先前的研究結(jié)果相符，證明依賴結(jié)核菌感染小鼠模型建立成功。利福平與VPA聯(lián)合治療組與單獨(dú)的利福平治療組相比，荷菌量大大減少(4.90±0.22 vs 6.27±0.88，P＜0.05)，說明VPA可以明顯抑制結(jié)核菌對(duì)利福平的依賴性，這種抑制在體外培養(yǎng)和動(dòng)物體內(nèi)都可以觀察到，說明利福平依賴性結(jié)核菌的形成機(jī)制與結(jié)核菌組蛋白乙?；鸬谋碛^遺傳關(guān)系密切。這為研究利福平依賴結(jié)核菌的形成機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)，并為臨床治療相關(guān)疾病提供了新的思路。

1 楊彩娥，董梅，匡鐵吉，等．結(jié)核分枝桿菌利福平依賴株與耐受株差異蛋白的篩選與鑒定［J］ .解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2009，34（9）：1124-1126，1136．

2 楊彩娥，趙利，王迪，等．結(jié)核分枝桿菌異煙肼依賴株與耐受株的耐藥性調(diào)查［J］.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，32（5）：453-454，470．

3 吳龍章，羅春明，吳幸怡，等．廣州市依賴藥物結(jié)核分枝桿菌分離率的初步調(diào)研［J］.中國防癆雜志，2011，33（1）：53-56.

4 匡鐵吉，宋萍，王利平，等. 分枝桿菌簡化瓊脂培養(yǎng)基的研究［J］.微生物學(xué)報(bào)，1995，35（4）：298-302.

5 Zhong M， Zhang X， Wang Y， et al. An interesting case of rifampicindependent/-enhanced multidrug-resistant tuberculosis［J］. Int J Tuberc Lung Dis， 2010， 14（1）： 40-44.

6 林紅巖，楊惠玉，廖暢隆，等. 耐多藥肺結(jié)核依賴?yán)Ｆ椒种U菌的實(shí)驗(yàn)觀察［J］.中國防癆雜志，2003，25（z1）：46.

7 董梅，楊彩娥，雷紅，等．利福平依賴結(jié)核病小鼠模型的建立［J］.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，32（10）：982-983，989．

8 Ross SA， Milner JA. Epigenetic modulation and cancer： effect of metabolic syndrome?［J］. Am J Clin Nutr， 2007， 86（3）：s872-s877.

9 Wilson AS， Power BE， Molloy PL. DNA hypomethylation and human diseases［J］. Biochim Biophys Acta， 2007， 1775（1）： 138-162.

10 Migheli F， Migliore L. Epigenetics of colorectal Cancer［J］. Clin Genet， 2012， 81（4）： 312-318.