Ezrin與 MMP2在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及意義

程 開,吳雯婷,董慧慧

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科,黑龍江 佳木斯 154003)

結(jié)腸癌(carcinoma of colon)是結(jié)腸黏膜上皮和腺體發(fā)生的惡性腫瘤[1]。近年來大腸癌的發(fā)病率與死亡率有逐年上升的趨勢[2]。腫瘤轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌高死亡率的主要原因[3]。相關(guān)研究已證實(shí),埃茲蛋白(Ezrin)與基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中,參與并促進(jìn)了許多重要步驟,包括:細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的重構(gòu),細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的抗原識(shí)別,改變細(xì)胞間黏附力,促進(jìn)新血管形成,影響腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞間的作用。Ezrin蛋白與 MMP-2在促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移中的作用聯(lián)合研究,國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用免疫組化法檢測正常結(jié)腸組織及結(jié)腸癌組織中兩蛋白含量,探討兩蛋白在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

鼠抗人 Ezrin單克隆抗體,鼠抗人 MMP2單克隆抗體,免疫組化 SP檢測試劑盒,DAB顯色試劑盒,EDT A抗原修復(fù)液,PBS磷酸鹽緩沖液(粉劑),粉劑型抗原修復(fù)液(檸檬酸法 ),多聚酶結(jié)合物 ,放大劑 (鼠 /兔 ),LEICA RM1020脫水機(jī) ,ShanDoN Histocentre 3(包埋機(jī) ),LEICA RM 2235切片機(jī),LEICA HI1220烘片機(jī),LEICA HI1210攤片機(jī),電壓力煲,照相顯微鏡。

1.2 方法

①留取自2011-01～ 2012-06佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院結(jié)腸癌手術(shù)標(biāo)本 48例,對以上48例標(biāo)本留取切端組織 (作為正常組織標(biāo)本)。術(shù)后立即取材,每例留取標(biāo)本大小約1.0cm×1.0cm×1.0cm。②取好的組織塊放入脫水機(jī),依次經(jīng)過甲醛,由低到高梯度酒精脫水,二甲苯及石蠟固定包埋。③冰凍組織蠟塊后經(jīng)切片、展片、烤片制成片子。④切片經(jīng)二甲苯,脫蠟,二甲苯,由高到低梯度酒精,蒸餾水沖洗,PBS液洗3次。⑤高溫修復(fù)法修復(fù)組織抗原,PBS液洗片3次。⑥滴加一抗 50μL,4℃冰箱內(nèi)過夜,PBS液洗片3次。⑦滴加放大劑50 μL,室溫靜置 10min,滴加多聚酶結(jié)合物 50 μL,室溫靜置1h,PBS液洗片3次。⑧滴加顯色劑 DAB,蘇木精復(fù)染2min,鹽酸酒精分化,氨水返藍(lán) ,由低到高濃度梯度酒精,二甲苯,最后封片,鏡檢。

1.3 染色結(jié)果判定

Ezrin蛋白以胞漿呈棕黃色染色為陽性,MMP-2蛋白主要以胞膜呈棕黃色為陽性,可有少量胞漿棕黃色染色,且其著色強(qiáng)度高于背景非特異性染色者判定為陽性。以每張切片中陽性細(xì)胞占全部癌細(xì)胞的比例計(jì)算,每高倍鏡隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù),完全陰性或陽性率 ＜5%為陰性 (-);其余記為陽性(+)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理 ,采用 SPSS Statistics17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,本試驗(yàn)數(shù)據(jù)資料為定性資料,對組間差異選用卡方檢驗(yàn),相關(guān)性選用相關(guān)分析,設(shè)定 P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ezrin蛋白組免疫組化結(jié)果

結(jié)腸癌組織與正常結(jié)腸組織對比,Ezrin的表達(dá)有顯著差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＜0.01,i2= 45.511)。在結(jié)腸癌組織中 ,Ezrin的表達(dá),與性別、年齡、分化程度無關(guān),無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P值分別為0.412、0.650、0.782,均 ＞ 0.05);與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同 Duke’s病理分期有顯著差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為 0.007、0.026,均 ＜ 0.05)。

2.2 MMP2蛋白組免疫組化結(jié)果

結(jié)腸癌組織與正常結(jié)腸組織對比,MMP2的表達(dá)有顯著差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＜0.01,i2= 43.344)。在結(jié)腸癌組織中,MMP2的表達(dá) ,與性別、年齡、分化程度無關(guān),無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P值分別為0.184、0.051、0.118,均 ＞ 0.05);與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同 Duke’s病理分期有顯著差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為 0.017、0.039,均 ＜ 0.05)。

2.3 Ezrin蛋白與 MMP-2蛋白相關(guān)性分析

48例結(jié)腸癌組織中 Ezrin與 MMP2兩者表達(dá)均陰性的有 5例,均陽性的有27例 ,Ezrin陽性同時(shí) MMP2陰性的有 7例,Ezrin陰性同時(shí) MMP2陽性的有 9例。Ezrin蛋白與 M MP-2蛋白無相關(guān)性 (P= 1.210,R= 0.159,P＞ 0.05)。

3 討論

埃茲蛋白作為膜骨架連接蛋白,是這一龐大反應(yīng)體系中,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移的重要成員之一。在正常細(xì)胞中,Ezrin蛋白一面以 N端高度保守的 FERM域結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜整合蛋白胞內(nèi)面直接相連,或通過與膜周蛋白 EBP-50的PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合間接連接膜整合蛋白;另一面以 C端 actin結(jié)合位點(diǎn)與細(xì)胞骨架中絲狀肌動(dòng)蛋白[4]相連;而連接 N端與C端的中央?yún)^(qū)是α螺旋結(jié)構(gòu)。正是由于埃茲蛋白這一特異分子空間結(jié)構(gòu),才賦予其重要的生理功能,即維持細(xì)胞正常形態(tài),參與細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)轉(zhuǎn)移及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),參與細(xì)胞的生存及死亡。在 Ezrin的蛋白分子鏈上,存在多個(gè)功能位點(diǎn),如:絲氨酸殘基,酪氨酸殘基,賴氨酸殘基,蘇氨酸殘基[5];每種殘基又有多個(gè)存在位點(diǎn)。這些殘基都可通過復(fù)雜的機(jī)制被激活,使埃茲蛋白構(gòu)象呈開放狀態(tài),促進(jìn)各種細(xì)胞膜運(yùn)動(dòng),影響膜整合蛋白粘附功能,通過影響多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間接參與腫瘤細(xì)胞的遷移?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)的埃茲蛋白可直接或間接影響的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括:Rho信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[6],賴氨酸受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,M APK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[7],PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,APO1/Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑。

基質(zhì)金屬蛋白酶-2是 MMPs(基質(zhì)金屬蛋白酶家族)中重要成員之一。MMP-2屬于明膠酶類的一種,主要酶解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜中的Ⅳ型膠原和明膠。在正常情況下,MMP-2與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIM P)共同存在,并以一定比例始終保持著某種動(dòng)態(tài)平衡,共同維持著細(xì)胞外基質(zhì)新陳代謝的正常有序地進(jìn)行,并保持著基底膜的完整性。當(dāng)腫瘤微環(huán)境存在時(shí),腫瘤細(xì)胞自身也合成并分泌基質(zhì)金屬蛋白酶,酶原形式的基質(zhì)金屬蛋白酶2,通過一些相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活后 ,成為活化狀態(tài),活化的 MMP-2可與基底膜上受體結(jié)合,促進(jìn)蛋白水解酶的激活及釋放,這樣細(xì)胞外基質(zhì)中的 M MP-2相對于 TIM P-2過多,導(dǎo)致 ECM中明膠過度降解,BM的完整性破壞。腫瘤細(xì)胞這是就可利用細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜中的破損區(qū)域做定向運(yùn)動(dòng),突破這道天然免疫防線基底膜,遷徙到腫瘤周圍組織,還可進(jìn)一步破壞血管的壁,利于腫瘤細(xì)胞和 MMP-2自身隨血液循環(huán)到達(dá)遠(yuǎn)處形成轉(zhuǎn)移灶。

從本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果看,Ezrin蛋白和 MMP-2在腫瘤細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移中都有促進(jìn)作用,但 Ezrin與 MMP-2無相關(guān)性。二者在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷徙,擴(kuò)散過程中,都通過多種方式,多種途徑直接或間接促進(jìn)、參與、影響腫瘤轉(zhuǎn)移 ,其中都通過影響細(xì)胞膜上黏附分子起作用。埃茲蛋白在胞內(nèi)對黏附分子作用,基質(zhì)金屬蛋白酶在胞外影響細(xì)胞黏附分子,從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果兩者無相關(guān)性推測,二者在影響?zhàn)じ椒肿舆^程中,并不存在共同途徑,而是通過各自不同的方式途徑影響腫瘤細(xì)胞黏附性,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤于轉(zhuǎn)移的。二者各自影響腫瘤細(xì)胞黏附性的途徑及機(jī)制尚不清楚,有待國內(nèi)外相關(guān)學(xué)者的共同努力,深入研究。

圖1 結(jié)腸癌組織中 Ezrin蛋白免疫組化染色(400倍)胞漿染色

圖2 結(jié)腸癌組織中 M MP2蛋白免疫組織染色(400倍)胞膜染色

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