纖維蛋白膠復(fù)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白與VEGF修復(fù)兔橈骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

肖裕華 ，李紹琴 ，潘文峰 ，李建飛 ，陳宗和

（1.江西省人民醫(yī)院骨一科，南昌 330006；2.上高縣中醫(yī)院骨科，江西 上高 336400）

骨缺損修復(fù)治療一直是臨床上的難題之一，目前尚無妥善的解決方法。隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，骨組織工程技術(shù)為骨缺損的修復(fù)提供了新的方法。目前大部分研究集中于支架性骨修復(fù)材料，但其需要手術(shù)切開才能應(yīng)用，不適用于只需要非手術(shù)治療的骨折，且修復(fù)材料內(nèi)部的再血管化問題一直未得到有效的解決[1]。纖維蛋白膠（FS）具有良好的生物相容性和可注射性。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）可誘導(dǎo)誘導(dǎo)性骨源性前體細(xì)胞向確定性骨源性前體細(xì)胞分化[2]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是促進(jìn)血管生長最重要的生長因子，對骨折愈合過程中的血管增生發(fā)揮著重要的作用。筆者的前期研究表明，用可注射的FS為載體復(fù)合BMP和VEGF具有良好的誘導(dǎo)大鼠異位成骨作用[2]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上探索以FS為載體復(fù)合BMP和VEGF的新型骨修復(fù)材料修復(fù)兔橈骨節(jié)段性缺損，通過X線攝片觀察測量、生物力學(xué)測試、組織形態(tài)學(xué)觀察等手段，評價(jià)其修復(fù)的效果，為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料的制備

FS（廣州倍秀生物技術(shù)有限公司）抑胰肽酶溶液內(nèi)分別加入rhBMP-2（北京華宇泰克生物工程公司）和VEGF（美國Ebioscience公司）。

1.2 可注射型組織工程骨的構(gòu)建

注射型組織工程骨由溶液Ⅰ和Ⅱ組成。溶液Ⅰ，為催化劑溶液，其成分為 CaCl2（40 mmol·mL-1）、凝血酶（400 U·mL-1）及 VEGF 和 rhBMP-2 凍干粉用重蒸水溶液組成；溶液Ⅱ?yàn)橐砸蛛拿溉芤喝芙饫w維蛋白原（80 mg·mL-1）。使用時(shí)以雙聯(lián)注射器分別吸入溶液Ⅰ、Ⅱ，注入體內(nèi)后約25 s形成黏稠果凍狀凝膠。rhBMP-2的濃度為2.5 mg·L-1，VEGF的濃度為0.3 mg·L-1。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物分組、模型的建立及藥物處理

健康的新西蘭大白兔24只，雌雄不拘，3個(gè)月齡，體質(zhì)量為2.0～2.5 kg，由南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部提供。隨機(jī)分為A、B、C 3組，每組8只，編號分籠飼養(yǎng)。采用速眠新、氯胺酮和阿托品復(fù)合液肌內(nèi)注射麻醉。麻醉成功后，將動物仰臥固定于兔臺上，術(shù)區(qū)備皮消毒，鋪無菌巾。以雙側(cè)前肢橈骨中段為中心行約3 cm直切口，切開皮膚鈍性分離皮下組織，于肌間隙暴露橈骨，線鋸取骨，連同骨膜切除造成約10 mm節(jié)段骨缺損，缺損區(qū)用無菌干紗布填塞止血，建立兔橈骨節(jié)段性缺損模型。

A組將FS+VEGF+BMP經(jīng)正常皮膚注射骨缺損處、B組將FS+BMP經(jīng)正常皮膚注射骨缺損處、C組將FS注射骨缺損處，各組根據(jù)骨缺損大小，植入相應(yīng)材料體積約0.5 mL。逐層縫合切口，術(shù)后3 d連續(xù)肌內(nèi)注射青霉素40萬U·d-1。每組均于術(shù)后6、12周各處死4只動物取材（骨缺損處）。

1.4 大體標(biāo)本觀察

術(shù)后觀察動物飲食、日?；顒幽芰靶g(shù)后傷口愈合情況。觀察組織工程骨的表面變化、骨痂形成、骨缺損修復(fù)情況及周圍組織反應(yīng)。

1.5 組織學(xué)觀察

各組于術(shù)后6、12周分別取4只兔標(biāo)本 （包括植入體、受體界面遠(yuǎn)近端各0.5 cm），小心剝離界面區(qū)組織，所取標(biāo)本置于10%甲醛液中固定24 h，10%硝酸脫鈣2 d，水洗，系列脫水，常規(guī)石蠟包埋，縱切，厚度5 μm，HE染色，光鏡下觀察各組缺損再生性修復(fù)情況。

1.6 X線檢查

曝光條件為40 kV，50 mA，0.2 s，距離為60 cm。拍攝兔橈骨正位X線片，觀察術(shù)區(qū)骨修復(fù)情況。阻射密度以同一X線片骨缺損臨近正常骨區(qū)域相同面積皮質(zhì)骨密度為100、相同面積X線片底色設(shè)為0測量的骨缺損阻射密度相對值表示。

1.7 生物力學(xué)測試

取A、B組術(shù)后12周骨缺損愈合的尺、橈骨各8根于萬能材料實(shí)驗(yàn)機(jī)上行抗扭轉(zhuǎn)、垂直壓縮及三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，計(jì)算機(jī)記錄測試數(shù)據(jù)并繪制力位移曲線，根據(jù)曲線計(jì)算其扭轉(zhuǎn)剛度、壓縮剛度、最大折斷力及抗折彎剛度。C組無骨性愈合標(biāo)本，未行生物力學(xué)檢測。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

術(shù)后1～3 d所有兔精神、飲食稍差，活動少，無畏寒、發(fā)熱征象，全身未見皮疹，手術(shù)切口無明顯紅腫、滲液等。4 d后精神好轉(zhuǎn)，飲食正常，活動增加。

2.2 大體標(biāo)本觀察

術(shù)后6周A組骨缺損的斷端出現(xiàn)硬度較多的類骨樣組織；B組骨缺損斷端類骨樣生成較少，纖維組織量較多；C組均為較致密的纖維組織。術(shù)后12周A組骨缺損區(qū)已完全修復(fù)，新生骨直徑較鄰近宿主骨直徑大小較一致，完全離斷后發(fā)現(xiàn)髓腔已再通（封四圖1A）；B組可見骨缺損部位有連續(xù)性新骨生成，但直徑較鄰近宿主骨部分略纖細(xì)（封四圖1B）；C組僅在骨缺損斷端見少量新生骨，缺損區(qū)域填充大量纖維組織（封四圖1C）。

2.3 組織學(xué)觀察

術(shù)后6周，A、B、C 3組骨缺損處纖維蛋白凝膠均大部分降解吸收。A組新生組織周圍見新生血管豐富，纖維組織下有大量新生骨組織，明顯鈣鹽沉積，可見骨小梁結(jié)構(gòu)，部分區(qū)域有髓腔樣結(jié)構(gòu)形成（封四圖2A）。B組新生組織為纖維組織充填，新生血管不如A組豐富，有散在片狀骨小梁結(jié)構(gòu)，骨細(xì)胞較多，骨組織較少（封四圖2B）。C組新生組織為纖維組織結(jié)構(gòu)，成纖維細(xì)胞豐富，未見成骨（封四圖2C）。術(shù)后12周，A組為成熟骨組織結(jié)構(gòu)，骨基質(zhì)豐富，骨細(xì)胞縮小，可見少量破骨細(xì)胞，骨髓腔貫通，可見造血細(xì)胞（封四圖3A）。B組骨組織成熟度較A組稍差，髓腔結(jié)構(gòu)不完整（封四圖3B）。C組仍以纖維結(jié)締組織為主，中間僅見少量島狀或片狀骨組織（封四圖 3C）。

2.4 X線表現(xiàn)

術(shù)后6周：A組宿主骨與植入組織之間界面模糊，出現(xiàn)較多骨痂，骨缺損部位出現(xiàn)較多散在的密度增濃影；B組骨斷端出現(xiàn)骨痂量較少，骨痂不連續(xù)，密度不高；C組可見清晰骨缺損區(qū)，只在截骨斷端有少許骨痂形成。術(shù)后12周：A組骨缺損處的骨痂已完全骨化，直徑與宿主骨的直徑較一致，髓腔貫通。B組缺損區(qū)骨癡密度、數(shù)量增加，但直徑小于斷端宿主骨。C組骨缺損區(qū)依然清晰，部分?jǐn)喽擞不Ｖ股L。術(shù)后6、12周骨缺損修復(fù)的X線阻射密度值均為A組＞B組＞C組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組骨缺損分析平均阻射密度值 x±s

2.5 生物力學(xué)測試

A組標(biāo)本壓縮、扭轉(zhuǎn)剛度及三點(diǎn)彎曲最大負(fù)荷生物力學(xué)表現(xiàn)均優(yōu)于B組（表2）。

表2 A、B組術(shù)后12周標(biāo)本壓縮、扭轉(zhuǎn)剛度及三點(diǎn)彎曲最大負(fù)荷的比較 ±s

表2 A、B組術(shù)后12周標(biāo)本壓縮、扭轉(zhuǎn)剛度及三點(diǎn)彎曲最大負(fù)荷的比較 ±s

*P＜0.05與B組比較。

組別 n 壓縮剛度（N·m-1） 扭轉(zhuǎn)剛度（N·m-1） 最大負(fù)荷/N A 組 8 （305.32±4.78）×103* （89.41±1.64）×10-3*175.49±8.32*B 組 8 （265.41±5.63）×103 （75.39±1.75）×10-3 145.81±9.45

3 討論

BMP是一種高效的骨誘導(dǎo)生長因子，它能誘導(dǎo)血管周圍未分化間充質(zhì)細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化為成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨細(xì)胞的生長增殖，進(jìn)而合成膠原，形成鈣化的骨組織，它可以促進(jìn)原位或異位骨的形成[3]。 研究[4]表明，BMP-2 是促進(jìn)骨形成和誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化最重要的細(xì)胞外信號分子之一，BMP-2/Smads/Runx2/Osterix信號通路和BMP-2/Smads/Msx2/Osterix信號通路是骨組織形成過程中間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞外基質(zhì)合成、分泌所必需的。BMP-2通過激活Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)成骨基因轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮其成骨作用。VEGF具有強(qiáng)的促血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的作用，增加血管通透性及血管維持功能，有利于毛細(xì)血管的生成，為局部材料的降解及新骨的形成創(chuàng)造最佳的微環(huán)境；還能提高成骨細(xì)胞的活性和軟骨內(nèi)成骨，從而促進(jìn)骨形成，并且血管內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間還存在生長因子分泌和旁分泌的相互關(guān)系[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，BMP和VEGF在骨愈合中對成骨有相互依賴及調(diào)控的作用[6]。但VEGF和BMP在體內(nèi)半衰期短，直接注人體內(nèi)易降解，故外源性單純給予上述蛋白的治療效果有限[7]。FS是一種具有多向生物活性的生物蛋白制劑，由纖維蛋白原、凝血酶及其他生物活性因子組成，具有止血、趨化及促細(xì)胞有絲分裂等特性，氯化鈣與抑肽酶是影響纖維蛋白凝固穩(wěn)定性的2種重要成分[8-9]。FS具有多孔的三維立體結(jié)構(gòu)，細(xì)胞容易貼附，利于營養(yǎng)物質(zhì)的滲透及代謝產(chǎn)物的排出；還有良好的骨傳導(dǎo)性及可降解可塑性，容易與其他生物活性材料制成注射劑，操作十分簡便。

筆者的前期實(shí)驗(yàn)研究表明，F(xiàn)S復(fù)合VEGF和BMP具有良好的誘導(dǎo)異位成骨的作用，其機(jī)制可能是FS天然的網(wǎng)狀微觀結(jié)構(gòu)有助于BMP、VEGF的附著和BMP、VEGF與靶細(xì)胞接觸，利于BMP和VEGF的緩慢釋放。因此，隨著FS的降解，在植入材料的周圍形成了一個(gè)BMP濃度梯度，增加了BMP和VEGF與靶細(xì)胞作用的時(shí)間，并且FS作為生物性材料，其內(nèi)部良好的微環(huán)境及大分子蛋白可保護(hù)BMP和VEGF不發(fā)生非特異性蛋白水解，從而使其骨誘導(dǎo)活性及促進(jìn)增殖活性得以最大限度地發(fā)揮。本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用FS成形前各成分為液體的特性，復(fù)合BMP和VEGF，在體外構(gòu)建出可注射狀的組織工程骨用于修復(fù)兔橈骨缺損。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從組織學(xué)方面觀察,術(shù)后6周A組新生組織周圍見豐富的新生血管，纖維組織下有大量新生骨組織，明顯鈣鹽沉積，可見骨小梁結(jié)構(gòu)，部分區(qū)域有髓腔樣結(jié)構(gòu)形成。這表明本方法構(gòu)建的組織工程骨體內(nèi)植入后有較好的促細(xì)胞增殖作用和血管化作用。而B組新生血管不如A組豐富，有散在片狀骨小梁結(jié)構(gòu)，骨細(xì)胞較多，骨組織較少。C組僅形成纖維組織，未見骨細(xì)胞，新生血管較少。表明VEGF促進(jìn)新生血管組織的生長，一方面給細(xì)胞帶來豐富的營養(yǎng)，可促進(jìn)細(xì)胞的成活和增殖，另一方面也利于其他部位的間充質(zhì)細(xì)胞聚積于骨缺損部位。同樣，在X線檢測和生物力學(xué)檢測方面，A組修復(fù)兔橈骨缺損的效果明顯優(yōu)于B組及C組。

綜上所述，F(xiàn)S復(fù)合BMP和VEGF修復(fù)骨缺損的效果理想，明顯優(yōu)于只復(fù)合BMP及單純應(yīng)用FS的效果，說明VEGF+BMP促進(jìn)骨生長具有協(xié)同作用。同時(shí)，這種新型可注射型組織工程骨材料有望在臨床得到廣泛應(yīng)用。

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