二色補(bǔ)血草總黃酮的提取純化及其對大鼠激素水平的影響

歐 莉 苗彥霞 衛(wèi)培峰 王 杰

(陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

二色補(bǔ)血草是白花丹科補(bǔ)血草屬的多年生草本植物，別名血見愁、蒼蠅花 、蠅子草、燎眉蒿。主產(chǎn)于河北、河南、山西、內(nèi)蒙古、陜西、甘肅等地〔1〕。全草入藥，性味甘平，補(bǔ)血益氣，止血散瘀。主治功能性子宮出血、宮頸癌、月經(jīng)不調(diào)、腎盂腎炎、胃潰瘍等癥〔2〕。二色補(bǔ)血草以其確切的藥用價(jià)值而備受人們關(guān)注，近幾年來對此藥材的開發(fā)利用也逐漸深入〔3，4〕，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)二色補(bǔ)血草主要含黃酮、鞣質(zhì)、生物堿、沒食子酸等物質(zhì)，其乙醇提取物能明顯縮短小鼠出、凝血時(shí)間〔5，6〕。本論文以二色補(bǔ)血草醇提液為原料，利用大孔樹脂對其總黃酮進(jìn)行純化處理，并探討其對去勢大鼠血清雌二醇(E2)及孕酮(P)的影響，從而進(jìn)一步揭示二色補(bǔ)血草總黃酮治療功血的作用機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備 UV-1102紫外分光光度計(jì)，上海天美科技儀器公司;BS124S電子天平，德國塞多利斯有限公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮儀器廠;DHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司。

1.2 材料與試劑 二色補(bǔ)血草購自陜西眉縣德爾康藥材公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所;D101樹脂購自西安藍(lán)深交換吸附材料有限公司;E2、P放免試劑盒由天津市協(xié)和醫(yī)藥科技有限公司提供，批號(hào):201108;宮血寧膠囊:0.113 g/粒，由云南白藥集團(tuán)股份有限公司提供，批號(hào):20110408。青霉素注射液，規(guī)格:160萬U/ml，由哈藥集團(tuán)制藥總廠提供，批號(hào):A110810910。

1.3 方法

1.3.1 二色補(bǔ)血草總黃酮的提取與純化

1.3.1.1 對照品溶液的制備 精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，用60%乙醇溶解，定容于25 ml容量瓶中，即得蘆丁對照液體，濃度為4 mg/ml。

1.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用硝酸鋁比色法，在波長510 nm處測定吸光度。溶液的吸光度Y和黃酮的濃度X的關(guān)系為:Y=2.376 5X－0.020 8(線性質(zhì)量范圍為0.040 0～0.160 0 mg/ml，R2=0.999 5)，X 的單位為 mg/ml。

1.3.2 二色補(bǔ)血草總黃酮的提取 稱取一定量的二色補(bǔ)血草，用10倍量的60%乙醇溶液，于50℃水浴中提取3 h，共回流提取2次〔7〕，過濾，減壓濃縮至生藥量0.24 g/ml，過濾得二色補(bǔ)血草醇提取液。

1.3.3 二色補(bǔ)血草總黃酮的純化 采用D101樹脂對二色補(bǔ)血草總黃酮進(jìn)行純化，靜態(tài)吸附12 h后，先用水(3倍量)進(jìn)行洗脫，去掉濾液。再用70%乙醇(5倍量)進(jìn)行洗脫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，合并濾液，按1.3.1.2測定其吸光度。

1.3.4 二色補(bǔ)血草總黃酮的含量測定 精密稱定0.14 g(5 ml)二色補(bǔ)血草總黃酮提取物，溶于40 ml 60%乙醇溶液中，定容至 50 ml。取 1 ml，加水至 4 ml，加 5%NaNO20.4 ml，放置6 min，加 10%NaNO20.4 ml，放置 6 min，加 4.3%NaOH 4 ml，加水定容至10ml，搖勻后放置15min。在330nm波長處測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=2.376 5X－0.020 8(線性質(zhì)量范圍為0.040 0 ～0.160 0 mg/ml，R2=0.999 5)，計(jì)算二色補(bǔ)血草總黃酮含量。

1.3.5 二色補(bǔ)血草總黃酮對去勢大鼠血清指標(biāo)的影響

1.3.5.1 動(dòng)物造模 取180～220 g雌性SD大鼠90只 ，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。行卵巢切除術(shù)而進(jìn)行去勢造模。術(shù)后用青霉素40萬U·kg－1·d－1肌注，連用3 d，于術(shù)后第7天進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片檢查，并連續(xù)檢查5 d，以陰道涂片不出現(xiàn)角化上皮細(xì)胞作為去勢造模成功指標(biāo)。

1.3.5.2 動(dòng)物分組及指標(biāo)測定 選取造模成功的大鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為二色補(bǔ)血草總黃酮低、中、高劑量組、二色補(bǔ)血草水煎液組、宮血寧對照組和模型對照組。每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥14 d，末次給藥后進(jìn)行眼眶取血，采用酶免試劑盒檢測血清E2、P水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 二色補(bǔ)血草總黃酮的含量測定 二色補(bǔ)血草醇提液濃縮至生藥量0.24 g/ml，純化后浸膏中總黃酮含量為65.46%，即每克浸膏中含總黃酮0.065 46 g。

2.2 對去勢大鼠血清E2與P的影響 行卵巢切除術(shù)制造對大鼠進(jìn)行去勢造模成功，其模型對照組的各項(xiàng)所測指標(biāo)與假手術(shù)組組比較均有顯著性差異(P＜0.01)。給藥后，二色補(bǔ)血草總黃酮各劑量組和宮血寧組均可提高去勢大鼠血清中E2和P的含量，其中二色補(bǔ)血草總黃酮高劑量組對模型大鼠血清中的E2水平具有明顯的改善作用(P＜0.01)，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，陽性對照藥宮血寧也可顯著提高模型大鼠血清中的E2水平(P＜0.05)。見表1。

表1 二色補(bǔ)血草總黃酮對去勢大鼠血清E2、P 的影響(n=10，x±s)

3 討論

二色補(bǔ)血草中含有大量的化學(xué)成分，其中的黃酮類化合物因分子中具有酚羥基，故顯酸性。一般黃酮苷元難溶于水，易于溶于乙醇，甲醇，乙醚，氯仿等有機(jī)溶劑中，因此選擇乙醇作為溶劑提取黃酮，可有效提高原料的提取率。故本實(shí)驗(yàn)參照以往實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝，采取料液比為1∶15，濃度為60%的乙醇為提取劑，于50℃水浴中提取3 h，共回流提取2次，并采用D101樹脂對二色補(bǔ)血草總黃酮進(jìn)行純化。

根據(jù)排卵與否，通常將功血分為無排卵型及排卵型兩大類，前者最為多見，約占80% ～90%。由于卵巢功能衰退，卵泡數(shù)明顯減少，且對促性腺激素敏感性降低，雌激素明顯減少，促性腺激素水平升高，因達(dá)不到雌激素的正反饋水平而無排卵前LH峰形成，以致無排卵。由于卵巢不能有規(guī)律的排卵，孕激素缺乏，子宮內(nèi)膜因在單一雌激素作用下而發(fā)生不同程度的增生。當(dāng)雌激素水平突然下降或波動(dòng)幅度較大時(shí)，則發(fā)生雌激素撤退性或突破性出血。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，二色補(bǔ)血草總黃酮可能通過雌激素樣物質(zhì)與孕激素樣物質(zhì)的共同協(xié)同作用而治療功血，可避免由于功血患者體內(nèi)雌激素過多，孕激素缺乏，導(dǎo)致雌激素突破性的出血情況發(fā)生。但二色補(bǔ)血草總黃酮是如何作用于子宮內(nèi)膜靶器官，是否能促使功血患者子宮內(nèi)膜的修復(fù)還需要做進(jìn)一步的探索研究。

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