山核桃外殼植物多酚的提取及抗氧化活性研究

方苗利

（浙江醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，杭州，310053）

植物多酚也稱(chēng)為植物單寧，是一類(lèi)廣泛存在于植物葉、果實(shí)、根及樹(shù)皮等部位的多元酚化合物，在醫(yī)藥、食品、化工、農(nóng)業(yè)和材料等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用受到了人們的關(guān)注[1]。特別是植物多酚的抗氧化活性近年來(lái)更加受到了人們的重視[2-4]。

山核桃又名胡桃，植物胡桃科胡桃屬的一種。山核桃是浙江特有，并在全國(guó)占有重要地位的名特優(yōu)產(chǎn)品。山核桃產(chǎn)生的外殼量很大，大部分都廢棄在山中，從而污染環(huán)境、危害動(dòng)植物的生存。而山核桃外皮含有酚類(lèi)、鞣質(zhì)、有機(jī)酸、生物堿、氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、糖、多糖、配糖(甙)、皂甙、甾體、黃酮體、香豆素、萜類(lèi)內(nèi)脂化合物和蒽醌類(lèi)等化合物。2011年，曹鵬飛報(bào)道了用有機(jī)溶劑法從山核桃外殼中提取植物多酚的研究，并對(duì)不同的溶劑、溫度、提取時(shí)間、固液比對(duì)植物多酚提取率進(jìn)行了詳細(xì)的討論，為解決山核桃外殼的綜合利用和進(jìn)一步開(kāi)展植物多酚化合物的研究提供了思路[5]。

利用山核桃外殼中提取的植物多酚開(kāi)展抗氧化活性研究，可以進(jìn)一步擴(kuò)大山核桃的種植規(guī)模，為地方經(jīng)濟(jì)服務(wù)。因此，在本研究中首先利用水、丙酮水溶液和聚乙二醇水溶液對(duì)山核桃外殼植物多酚進(jìn)行了提取，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了提取物對(duì)油脂的抗氧化活性和對(duì)1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基清除能力的研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和原料

試劑：乙二胺四乙酸二鈉，氨水，氯化銨，醋酸鋅，鉻黑T，丙酮，乙醇，聚乙二醇400，硫代硫酸鈉，氯仿，甲醇，水楊酸，2,6-二叔丁基對(duì)甲酚，DPPH，均為市購(gòu)化學(xué)純。

原料：山核桃外殼。

1.2 植物多酚的提取方法

將30℃烘干除雜質(zhì)的核桃外殼10 g粉碎，裝入250 mL的錐形瓶中，在60℃溫度下，加入提取劑80 mL，攪拌浸提10 h后，趁熱過(guò)濾、洗滌，濾液進(jìn)行植物多酚含量測(cè)定。

1.3 植物多酚含量測(cè)定

Zn2+有較好的選擇性，只與植物多酚絡(luò)合。以過(guò)量的醋酸鋅為絡(luò)合沉淀劑加到植物多酚溶液內(nèi)，在pH=10、35℃下反應(yīng)30min，溶劑內(nèi)多余的Zn2+以乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）滴定。1mL濃度1mol/L的醋酸鋅消耗EDTA 0.155 6 g。具體步驟參照文獻(xiàn)[6]提供的方法，從而計(jì)算植物多酚的含量。

1.4 抗氧化性試驗(yàn)

1.4.1 對(duì)油脂的抗氧化性

油脂在氧化過(guò)程中，氧與不飽和碳鏈化合生成過(guò)氧化物，過(guò)氧化物與碘化氫反應(yīng)使碘離子氧化析出碘，然后用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定析出的碘，根據(jù)硫代硫酸鈉的消耗量可以得到油脂的過(guò)氧化值（POV）,通過(guò)POV可評(píng)價(jià)油脂的氧化程度[7-8]：

式中，V1和V2分別為樣品和空白消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，c為硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，m為樣品質(zhì)量。

將新鮮豬油切成小塊，用文火濕法熬煉，雙層紗布過(guò)濾除去殘?jiān)?，冷卻、密封后放入低溫冰箱備用。各取50 g新鮮豬油，1個(gè)做空白試驗(yàn)，1個(gè)加入山核桃外殼提取物，提取物分別按豬油質(zhì)量的0.02%、0.2%、0.5%、1%加入，可以加入適量乙醇溶解。置50℃水浴中緩慢加熱并攪拌下融化，然后在70℃恒溫箱中保存，每12 h攪拌1次，并確保2個(gè)樣品在同樣的環(huán)境條件。

測(cè)定時(shí)，準(zhǔn)確稱(chēng)取試樣3 g置于250 mL燒瓶中，加30 mL氯仿-冰醋酸混合液，使樣品完全溶解。加入1mL飽和碘化鉀溶液，輕輕震蕩30 s，然后在暗處放置10 min，取出加入100 mL水，搖勻，立刻用1mmol/L的硫代硫酸鈉溶液滴定，至淡黃色時(shí)加1 mL淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失為終點(diǎn)。每隔24 h平行測(cè)定2個(gè)樣品的POV，取樣時(shí)要充分振蕩使之混入足夠的空氣。

1.4.2 清除DPPH自由基活性

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的脂溶性的質(zhì)子自由基，具有穩(wěn)定、靈敏和簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛的應(yīng)用于評(píng)價(jià)短時(shí)間內(nèi)的抗氧化性研究。該測(cè)定方法是根據(jù)在電子供體的存在下，穩(wěn)定的DPPH自由基由紫色轉(zhuǎn)化為黃色，其色變程度與其接受的電子呈定量關(guān)系，清除自由基能力越強(qiáng)，吸光度越小。吸光度采用分光光度計(jì)檢測(cè)[9]。

溶液配制：DPPH樣品為0.2 mmol/L的甲醇溶液，提取物分別配成質(zhì)量濃度1 mg/mL和0.1 mg/mL的甲醇溶液。

分別測(cè)定未加樣品液的DPPH溶液、樣品液和加入樣品液反應(yīng)后DPPH溶液在517 nm下吸光度A0、As和A，計(jì)算清除率：

2 結(jié)果與討論

2.1 植物多酚的提取

目前通過(guò)文獻(xiàn)提供的提取方法，主要是采用水或丙酮的水溶液。從溶劑的回收再利用，或者是溶劑的使用安全考慮，使用聚乙二醇400水溶液作為提取劑，在反應(yīng)時(shí)間為10 h、溫度為60℃的條件下進(jìn)行了提取實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 植物多酚在不同溶劑中的提取率Tab 1 Extraction yield of plant polyphenols in different solvents

從表1可以看出，直接采用水提取率最高。

2.2 抗氧化性

將山核桃外殼提取物0.010、0.025、0.10、0.25、0.5 g分別加入到50 g豬油中，測(cè)定POV，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 植物多酚對(duì)豬油的POVFig 1 POV results of different plant polyphenols to lard

從圖1可以看出，提取物對(duì)豬油的氧化具有很好的抑制作用。隨著提取物加入量的增加，抗氧化性逐漸增強(qiáng)，當(dāng)提取物的加入量為0.10 g時(shí)，氧化效果最佳。但是隨著提取物加入量的再增加，抗氧化效果有些下降。分析認(rèn)為，多酚類(lèi)物質(zhì)自身不穩(wěn)定，隨著提取物量的增加，易發(fā)生自身氧化而使抗氧化作用降低；或者是多酚氧化物的顏色對(duì)測(cè)定結(jié)果有些影響。

2.3 清除DPPH自由基活性

山核桃外殼提取物對(duì)清除DPPH自由基的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 植物多酚對(duì)清除DPPH自由基的測(cè)定結(jié)果Fig 2 Determination results of DPPH free radicals removed by plant polyphenols

從圖2可以看出，清除率隨著提取物的質(zhì)量濃度的增加而增加，到100 mg/L時(shí)，清除率可達(dá)到90%以上。

3 結(jié)論

通過(guò)利用水、丙酮水溶液和聚乙二醇水溶液對(duì)山核桃外殼中植物多酚的提取結(jié)果表明，水是最佳的提取劑。該方法安全、效果好、無(wú)污染，可以變廢為寶，有較好的應(yīng)用價(jià)值。

通過(guò)山核桃外殼提取的植物多酚對(duì)油脂的抗氧化性和清除DPPH自由基的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，山核桃外殼提取物對(duì)油脂的抗氧化和清除DPPH自由基具有良好的效果。試驗(yàn)中使用的提取物是未經(jīng)純化的粗品，經(jīng)過(guò)深加工后，效果會(huì)更好。

[1]黃占華,方桂珍.植物單寧的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].林產(chǎn)化工通訊,2005,39(5):39-43.

[2]金瑩,孫愛(ài)東.植物多酚的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性的研究[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng),2005(9):27-29.

[3]邵芳芳,尹衛(wèi)平,梁菊.重要的植物多酚及其抗氧化性能的研究概況[J].西北藥學(xué)雜志,2010(1):66-68.

[4]徐竟一,李?yuàn)櫳?蘋(píng)果多酚的抗氧化性研究[J].廣西輕工業(yè),2011(5):13-14.

[5]曹鵬飛.山核桃外殼單寧提取的工藝條件研究[J].江西林業(yè)科技,2011(4):60-64.

[6]楊文云,李志國(guó),吳昊,等.絡(luò)合法測(cè)定塔拉單寧含量的研究[J].西南林學(xué)院學(xué)報(bào),1999,19(4):249.

[7]寧正祥.食品成分分析手冊(cè)[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,1998:167.

[8]揚(yáng)惠芳,李明元,沈文.食品衛(wèi)生理化檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)[M].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,1998:67.

[9]Barry H.Free radicals in biology and medicine[M].Oxford:Charendon Press,1985:37.