虎金丸對(duì)肝纖維化大鼠Nrf2/Bach1蛋白表達(dá)的影響

符 崖 黃兆勝 熊天琴 李紅俠 趙玉民 廖嘉儀

廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510006

在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中，氧化應(yīng)激起著重要作用，機(jī)體氧化/抗氧化的失衡，是肝臟炎癥及肝纖維化的發(fā)展重要因素之一。核因子相關(guān)因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）、轉(zhuǎn)錄因子 Bach1（BTB and CNChomology1）在機(jī)體氧化/抗氧化失衡的調(diào)節(jié)中起著重要的作用，Nrf2通過調(diào)節(jié)肝臟抗氧化酶基因的表達(dá)增加肝臟抵抗氧化應(yīng)激的能力；Bach1為Nrf2的阻遏劑，和Nrf2競爭ARE下調(diào)抗氧化酶基因的表達(dá)[1-4]。

虎金丸由虎杖、郁金、田七、靈芝、澤瀉、山楂6味組成，具有活血化瘀、益氣行滯的功效。臨床上用于治療肝纖維化有較好的療效[5]。研究表明虎金丸能保護(hù)CCl4所致大鼠肝細(xì)胞急性損傷，具有確切的抗肝纖維化作用[6]。本研究采用CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化，觀察虎金丸對(duì)肝纖維化大鼠Nrf2/Bach1蛋白表達(dá)的影響，初步探討虎金丸調(diào)整機(jī)體氧化應(yīng)激抗肝纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠，SPF級(jí)，體重150～180g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵）2008-0020。

1.2 藥物及試劑

虎金丸供試液系按處方比例各藥材加水煎煮2次，過濾，濃縮為含生藥1g/mL，臨用時(shí)稀釋備用；陽性對(duì)照藥水飛薊素（陜西森弗高科實(shí)業(yè)有限公司）；四氯化碳（廣州光華化學(xué)廠有限公司，批號(hào)20110930）；MDA、SOD、GSHPx檢測試劑盒（南京建成生物研究所）；兔抗Nrf2多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，規(guī)格1mg/mL），兔抗Bach1多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，規(guī)格37μg/150μL）。Elevision plus免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）；Masson三色染色液（廣州威佳科技有限公司，批號(hào)20110315）；蘇木素和伊紅（Sigma進(jìn)口分裝，批號(hào) 20110211）。

1.3 儀器

7080型日立全自動(dòng)生化分析儀器株式會(huì)社日立高新技術(shù)）；UV-754紫外可見分光光度計(jì)（上?？茖W(xué)精密儀器有限公司）；TG-16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)器有限公司）；體重計(jì)，大連星海電子衡器有限公司；MIAS圖像分析系統(tǒng)（廣州中醫(yī)藥大學(xué)一附院病理室）；MSHOT數(shù)碼成像系統(tǒng)（廣州市明美光電技術(shù)有限公司）。

1.4 造模及給藥方法

雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、水飛薊素組、虎金丸組，每組10只。模型組和給藥組皮下注射40% CCl4花生油溶液（將CCl4與花生油以4∶6配成40%油劑），首次0.5mL/100g，隨后0.3mL/100g，隔天1次，持續(xù)6周。正常組皮下注射等體積的花生油，時(shí)間與模型組相同。造模結(jié)束后，給藥組灌胃相應(yīng)藥物，每日1次，共4周。模型組、正常組灌胃等體積的蒸餾水。為了防止肝臟自然修復(fù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，除正常對(duì)照組外，各用藥組開始給藥后仍同時(shí)每周注射40% CCl4油劑0.3mL/100g體質(zhì)量1次[7]。

1.5 采集標(biāo)本

末次給藥前禁食不禁水12h，末次給藥后1h，用1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采集血液，將血液室溫靜置2h后，2500r/min，離心20min，取上清，-80℃保存?zhèn)溆?。采集血液后將?dòng)物處死取肝臟標(biāo)本，置于冰0.9%氯化鈉溶液中充分洗滌后，稱重，取肝右葉標(biāo)本1cm×1cm×0.5cm，用10%（v/v）的中性甲醛固定，制備石蠟切片。取肝左葉用生理鹽水制成10%的肝勻漿。

1.6 檢測指標(biāo)及方法

1.6.1 肝臟組織病理學(xué)觀察 肝組織病理學(xué)檢查采用膠原纖維染色（Masson法），在光鏡下觀察大鼠肝組織肝纖維化程度并拍照。MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)分析并自動(dòng)計(jì)算膠原纖維面密度。

1.6.2 分光光度法檢測 檢測肝組織勻漿中SOD、GSH-Px含量

1.6.3 免疫組化法檢測肝組織勻漿Nrf2、Bach1的蛋白量的差異 肝組織標(biāo)本經(jīng)10%甲醛液固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片貼于經(jīng)APES處理的載玻片。免疫組化按Elevision plus試劑盒要求操作。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。用MSHOT數(shù)碼成像系統(tǒng)采集圖像，MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)分析并自動(dòng)計(jì)算平均光密度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Masson染色膠原纖維觀察

正常組肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，除肝中央靜脈周和肝血竇周見少量的網(wǎng)狀纖維，無明顯膠原纖維增生。模型組肝組織結(jié)構(gòu)被破壞，肝索排列紊亂，局部的網(wǎng)狀纖維融合形成膠原纖維條索，使肝小葉中央?yún)^(qū)和匯管區(qū)的纖維間隔相互連接，改建肝小葉結(jié)構(gòu)和血液循環(huán)形成了假小葉。肝組織損傷減輕，肝索排列整齊，膠原纖維增生顯著減少。

在Masson染色中，纖維蛋白呈黃綠色，運(yùn)用MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)分析膠原纖維的面密度，根據(jù)面密度值判斷大鼠纖維化的程度。與正常組比較，模型組的面密度顯著增大（P＜0.01），面密度值為（0.206±0.059）。與模型組比較，水飛薊素與虎金丸均能顯著減低纖維蛋白的含量（P＜0.01），且虎金丸的作用更顯著。見表1。

表1 Masson染色膠原纖維面密度結(jié)果比較（± s）

表1 Masson染色膠原纖維面密度結(jié)果比較（± s）

注：與正常對(duì)照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 n 面密度正常組 8 0.014±0.008模型組 8 0.206±0.059▲▲水飛薊素組 8 0.100±0.035**虎金丸組 8 0.079±0.037**

圖1 大鼠肝組織Masson染色膠原纖維觀察（100倍）

2.2 大鼠肝組織勻漿中GSH-Px與SOD含量的變化

與正常組相比，模型組的抗氧化酶GSH-Px與SOD含量均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，兩藥物組均使GSH-Px與SOD含量顯著升高（P＜0.01），表明藥物的使用增強(qiáng)了機(jī)能的抗氧化酶含量，達(dá)到了保護(hù)肝臟的作用。見表2。

表2 大鼠肝組織勻漿中SOD、GSH-Px的含量比較（± s）

表2 大鼠肝組織勻漿中SOD、GSH-Px的含量比較（± s）

注：與正常對(duì)照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

水飛薊素組 10 256.291±58.119** 552.267±25.055**虎金丸組 10 254.718±7.854** 528.869±66.003**

2.3 大鼠肝組織勻漿Nrf2、Bach1蛋白的改變

與正常組比較，模型組肝細(xì)胞漿中的Nrf2蛋白顯著升高（P＜0.01），Bach1蛋白顯著降低（P＜0.01）。見圖2：A1、A2、B1、B2。與模型組比較，虎金丸、水飛薊素組肝細(xì)胞胞漿中的Nrf2蛋白顯著降低，Bach1蛋白顯著增高（P＜0.01）。見圖2：C1、C2、D1、D2。兩組之間的蛋白水平差異小。見表3。

3 討論

肝纖維化是各種肝損傷的共同的終末階段。正常的肝纖維結(jié)締組織的生成與分解保持動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)肝組織受到不同損傷時(shí)（如藥物性、酒精性損傷），肝纖維組織彌漫增生大于分解，導(dǎo)致肝纖維化[8]。研究表明，虎金丸對(duì)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化有較好治療作用，能夠保護(hù)肝細(xì)胞，抑制膠原纖維增生，其機(jī)理與抗脂質(zhì)過氧化有關(guān)[9]。現(xiàn)代藥理研究表明，虎杖鞣質(zhì)具有較好的抗脂質(zhì)過氧化的作用[10]，郁金主要有效成分姜黃素通過清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)發(fā)揮其抗氧化活性[11]，田七中的三七總皂苷抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[12]，靈芝的主要活性成分靈芝多糖、澤瀉總提物、山楂提取物均具有抗氧化作用[13-15]。

表3 大鼠肝組織細(xì)胞漿Nrf2、Bach1蛋白的平均光密度值比較（± s）

表3 大鼠肝組織細(xì)胞漿Nrf2、Bach1蛋白的平均光密度值比較（± s）

注：與正常對(duì)照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 n Nrf2-A Bach1-A正常組 8 0.171±0.024 0.190±0.011模型組 8 0.248±0.015▲▲ 0.149±0.010▲▲水飛薊素組 8 0.194±0.021** 0.204±0.021**虎金丸組 8 0.198±0.024** 0.201±0.006**

圖2 大鼠肝組織細(xì)胞漿Nrf2、Bach1蛋白的表達(dá)（200倍）

CCl4是最經(jīng)典和廣泛應(yīng)用的肝毒性物質(zhì)，一般認(rèn)為CCl4在肝細(xì)胞內(nèi)經(jīng)微粒體酶活化生成自由基，啟動(dòng)脂質(zhì)過氧化，造成肝損傷與纖維化[16]。從Masson染色結(jié)果來看，模型大鼠肝臟組織出現(xiàn)結(jié)構(gòu)破壞、肝索紊亂、膠原纖維增生與假小葉等肝纖維化現(xiàn)象，而虎金丸能改善肝纖維化，降低膠原纖維面密度。

機(jī)體受到氧化應(yīng)激損傷后，細(xì)胞漿中Bach1核移位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)和Nrf2競爭ARE，Nrf2出核降解，細(xì)胞漿中Nrf2水平增加，抗氧化酶的表達(dá)水平下降?？寡趸幚頃r(shí)，細(xì)胞漿中Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)，Bach1的核移出，細(xì)胞漿中Bach1水平增加[17-18]。實(shí)驗(yàn)表明，模型組肝細(xì)胞組織勻漿中的Nrf2表達(dá)顯著高于正常組，Bach1則顯著低于正常組，SOD、GSH-Px等抗氧化酶的表達(dá)的水平與活性低于正常組，提示在氧化應(yīng)激過程中Nrf2核移出，機(jī)體抗氧化酶水平降低。在藥物組中，抗氧化藥物的使用使機(jī)體的氧化/抗氧化失衡得到了調(diào)節(jié)，肝細(xì)胞組織勻漿中Nrf2水平回落，細(xì)胞漿中Bach1水平提高，SOD、GSH-Px等抗氧化酶的表達(dá)的水平與活性也得到了提高。這說明虎金丸可調(diào)控Nrf2/Bach1蛋白在肝細(xì)胞組織勻漿中的表達(dá)，通過核因子水平的變化調(diào)整SOD、GSHPx等抗氧化酶的含量與活性，從而達(dá)到調(diào)整氧化應(yīng)激抗肝纖維化的作用。

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