耐藥結(jié)核病的實驗室診斷及藥物相關(guān)性研究

魏建林

河北省邢臺市第二醫(yī)院檢驗科，河北邢臺054001

結(jié)核病為現(xiàn)今世界上最為普遍和嚴(yán)重的人類傳染病之一，早期診斷有利于疾病的治療及預(yù)防[1]。但缺乏特異性的抗原阻礙了結(jié)核病早期快速診斷及高保護性疫苗的研制[2]。為了探討以ASN及DH單獨或者聯(lián)合INH及RFP初步對耐RFP結(jié)核菌進行研究，該論文2011年9—12月將用多色流式細胞術(shù)檢測ELISPOT篩選所得的6條肽段的細胞免疫特性，檢測指標(biāo)為多肽特異性淋巴細胞 (CD4+或CD8+T細胞)分泌的細胞因子TNF-a，IL-4,IFN-y及同時分泌兩種因子的情況。

1 實驗技術(shù)路線

2011年9—12月，對耐藥結(jié)核病的實驗室診斷及藥物相關(guān)性進行實驗室研究工作，具體實驗技術(shù)路線如圖1所示。

圖1 青蒿素類耐藥實驗及逆轉(zhuǎn)

2 青蒿素類單體對耐多藥結(jié)核分枝桿菌的敏感性實驗

2.1 目的

該研究針對耐INH結(jié)核菌和耐RFP結(jié)核菌進行研究。以DHA(二氫青蒿素)和ASN（單體青蒿琥酯）單獨或者聯(lián)合INH以及RFP對其作初步研究，研究其是否具有殺死細菌，或者抑制細菌生長的作用;中藥單體配合RFP或INH是不是具有逆轉(zhuǎn)或協(xié)同結(jié)核菌耐藥性可以通過MB/BACT系統(tǒng)檢測。

2.2 材料

按相關(guān)規(guī)程——《結(jié)核病診斷細菌學(xué)檢驗規(guī)程》對某所贈與該院的結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株進行鑒定 （臨床分離株為該院微生物室保存）[3]。

對絕對濃度法藥物敏感實驗采用羅氏雞蛋固體培養(yǎng)基的方法進行。INH的耐藥臨界值15 g/mL、RFP的耐藥臨界值505 g/mL，在該次實驗中，一共具有13株菌株：MDR-TB：0株；INH敏感及RFP：I株；單耐 INH 或 RFP：1 株。

2.3 試劑

①Middle broth 7H9干粉:BD DIFCO公司產(chǎn)品。②OADC:購自上海市結(jié)核重點實驗室。③米氏7H9液:Middle broth 7H9干粉（4.7 g）；丙三醇2 mL；加1 L去離子水，高壓滅菌后無菌添加100 mL OADC。④二氫青蒿素液:用滅菌去離子水溶解，用滅菌去離子水稀釋到20 mg/mL。⑤二青蒿琥酯液:用附帶的NaHCO3（1 mL）溶解，稀釋到20 mg/mL（用滅菌去離子水）。⑥96孔細胞培養(yǎng)板:CORNING公司產(chǎn)品。⑦RFP,INH,Resazurin(刃天青)。⑧Bact/alert MP瓶及營養(yǎng)液。⑨金胺0-苯酚染色法。

2.4 方法

2.4.1 二氫青篙素及青蒿琥酯的抑菌作用 參照刃天青氧化還原顯色法檢測結(jié)核菌在含藥微量液體培養(yǎng)基中生長情況。簡述如下:用0.5%Tween 80生理鹽水研磨結(jié)核菌至乳濁狀后略沉淀，去其上層面的菌液，調(diào)至1個麥?zhǔn)蠁挝唬ㄓ妹资?H9液），之后對其進行稀釋，稀釋比例為：1∶10。將稀釋厚的液體加于孔板中（每孔加100 μL），之后，將稀釋后的青蒿素單體液加于孔板（每孔加入100 μL），使藥物終濃度為2 005 g/mL。對于無菌對照孔，加稀釋后的青篙素單體液 100 μL以及 7H9液100 μL。對于無藥生長對照孔，加相應(yīng)菌液及7H9液各100 μL。直至第4天，將各孔中均加入20 μL刃天青貯存液，之后對各孔的顏色進行詳細觀察和記錄（由藍色變?yōu)樽霞t色的程度），第14天，將各孔液體吸出，并進行金胺O-苯酚熒光染色。

2.4.2 耐藥菌的作用 按照MBBACT240操作手冊進行，比較耐藥菌在含藥液體培養(yǎng)基中的生長速度。為使青蒿素類單體逆轉(zhuǎn)細菌耐藥，先將青蒿素類單體與細菌相應(yīng)作用24 h后，再加入營養(yǎng)液及RFP或INH。操作步驟簡述如下:用旋渦震蕩器將菌濃度為1個麥?zhǔn)蠁挝坏年栃越Y(jié)核瓶震蕩1 min后備用。一株細菌共標(biāo)記7只結(jié)核培養(yǎng)瓶，（GC.RFP/GC.INH/DHA.RFP/ASN.INH/GC.INH/ASN.RFP/DHA）;7只瓶中均注入相應(yīng)青高素單體藥液 (用生理鹽水代替青蒿素類單體注入GC.INHIGC.RFP/GC瓶)及菌液各0.5 mL，注入后要求瓶內(nèi)DHA或ASN終濃度為200 μg/mL;24 h后，取出將瓶置MBBACT培養(yǎng)儀，將營養(yǎng)液及INH或RFP貯存液(除 GC瓶外)各注入 0.5 mL，使終濃度為 2 μL/mL，最后將瓶上機培養(yǎng)。

2.5 統(tǒng)計方法

對收集的數(shù)據(jù)運用統(tǒng)計軟件SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進行t檢驗。

3 結(jié)果

二氫青蒿素及青蒿琥酯的抑菌作用：通過觀察實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：無菌對照孔沒有變色，其他對照孔均存在變色現(xiàn)象。在14 d內(nèi)，無藥對照生長孔和青蒿素單體孔雖未能變?yōu)橥耆奂t色，但都變?yōu)榉奂t色或接近粉紅色；金胺O-苯酚熒光染色顯示無藥對照孔及青蒿素單體孔均為抗酸陽性，且細菌成團熒光明顯增強，這就表明青蒿素單體孔和生長對照孔均有分枝桿菌生長，說明此兩者均不能單獨抑制結(jié)核分枝桿菌生長。

經(jīng)Fisher's exact test統(tǒng)計學(xué)處理后顯示(數(shù)據(jù)不在此一一列出)，與相應(yīng)INHIGC或RFP/GC相比，青蒿素類單體聯(lián)合INH或RFP其單側(cè)P值均遠＜0.05，顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 RFP及INH聯(lián)合青篙素類單體對11株耐RFP或INH結(jié)核菌的效果

通過對青蒿素類聯(lián)合RFP作用耐RP結(jié)核菌的陽性檢測時間、RFP及INH聯(lián)合青蒿素類單體對11株耐RFP或INH結(jié)核菌的效果、青蒿素類聯(lián)合INH作用耐INH結(jié)核菌的陽性檢測時間得出的數(shù)據(jù)分析得出：對耐藥結(jié)核菌，青蒿琥酯及二氫青蒿素聯(lián)合INH或RFP均表現(xiàn)出了良好的敏感性，推測有逆轉(zhuǎn)耐INH或RFP的作用。以上實驗數(shù)據(jù)還說明一個結(jié)果：二氫青蒿素的敏感率沒有青蒿琥酯的高。

4 討論

此次實驗，少數(shù)試驗菌株MP儀器法的結(jié)果與其羅氏法藥敏的結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，針對這種形象，我國有許多學(xué)者對其進行了研究分析[4]，認為其主要原因在于：MP系統(tǒng)藥物濃度及結(jié)敏結(jié)果更為準(zhǔn)確是因為其培養(yǎng)時間短，藥物降解更低。

該研究在設(shè)計時，為了延長青蒿素聯(lián)合RFP與RFP/GC的時間差，縮短RFP/GC與GC時間差，考慮將RFP濃度定為25 g/mL，這種做法是為了更好地體現(xiàn)青素單體聯(lián)合抗菌藥物的作用，并試圖更好地將單體的效果體現(xiàn)出來。

通過該身實驗，可以得出以下結(jié)論：體外單獨應(yīng)用青蒿琥酯或二氫青蒿素不能將結(jié)核分枝桿菌殺死或者將其抑制。通過對在此次進行的顯色試驗結(jié)果進行分析，得出：在相同的培養(yǎng)時間內(nèi)，對不同配合體的孔板進行認真觀察，有少數(shù)對照孔的顏色沒有含藥孔的顏色紅，MP法中亦有菌株3081其RFP/ASN瓶比GC瓶早報陽2.7 d，這些均表明：某些結(jié)核分枝桿菌的生長可能由青蒿素類單體引起[5]。

通過該研究可以得出：對于耐藥結(jié)核分枝桿菌，INH或RFP聯(lián)合二氫青蒿素或青蒿琥酯是有效的，且青蒿琥酯比二氫青蒿素的敏感率高，其機制可能是協(xié)同或者逆轉(zhuǎn)細菌的耐藥程度。

[1] 蔡江麗,秦蓮花.結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白64抗體適應(yīng)的獲得及血清學(xué)檢測[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2010,33(4):309-310.

[2] 王慶,金玉蓮,李建農(nóng).四種方法檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性結(jié)果的比較及方法評價[J].中華傳染病雜志,2007,25(11):690-694.

[3] 陳芳,曾杰.DC-SIGN特異性適體的篩選及鑒定[J].細胞分子免疫學(xué)雜志,2008,24（12）:1133-1136.

[4] 張慧卿,方念.適體篩選技術(shù)[J].中國生物工程雜志,2008,28（1）:113-118.

[5] 甄蓓,宋亞軍.體外篩選碳疽芽飽適體[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報,2002，34（19）:635-642.