失眠大鼠5-HT、5-HIAA、NE的針刺時效研究

蘭 妮 趙倉煥 徐擁建

（柳州市柳鐵中心醫(yī)院·545007）

與藥物治病一樣，針灸是一種重復(fù)使用的治療方法。對于針灸治療疾病的間隔時間，目前臨床上大多數(shù)醫(yī)生是依靠各自的經(jīng)驗，每天治療1 次、2 次或隔日1 次，這是否為最佳的治療間隔時間，能否取得最佳的治療效果，目前還缺乏科學(xué)的根據(jù)。以往的研究證明了電針對PCPA 致失眠大鼠鎮(zhèn)靜催眠時可明顯升高5-HT、5-HIAA 含量，降低NE 含量[1]。為了探討電針治療失眠癥的最佳間隔時間及其機理,本研究通過檢測PCPA 致失眠大鼠單次電針后下丘腦5-HT、5-HIAA 及NE的含量，觀察電針后效應(yīng)隨時間延續(xù)的變化，為臨床上選擇合適治療間隔時間提供一定實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級健康雌性Wistar 大鼠，體重180～220g。由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物房提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2008-0020，NO：0055714。

1.2 動物分組及處理

將合格的96 只大鼠隨機分為電針組、模型組、對照組三大組，每組32 只動物。每組又根據(jù)電針后處理時間的不同分為3h 組、6h 組、12h 組和24h 組4 小組，其中每小組各8 只。失眠動物造模方法：將PCPA(45mg/100g)用弱堿性生理鹽水(pH7.0～8.0)配置成混懸液，按1ml/100g 用量腹腔注射，1次/日，連續(xù)注射2日。

(1)電針組：于實驗前連續(xù)兩天腹腔注射PCPA 制備失眠動物模型，實驗當(dāng)天予電針治療1 次，在電針后對應(yīng)時間處死大鼠取腦組織測定指標(biāo)。

(2)模型組：同電針組造模，于實驗當(dāng)天與電針組同方法固定20min，在固定后對應(yīng)3h、6h、12h、24h 時處死大鼠取標(biāo)本。

(3)對照組：不造模，于實驗前連續(xù)兩天腹腔注射同PCPA 用量體積的弱堿性生理鹽水，其他處理同模型組。

1.3 電針方法

(1)取穴：穴位的定位參照《大鼠穴位圖譜的研制》（華興邦1991年發(fā)表于《實驗動物與動物實驗》）。神門穴：大鼠前肢內(nèi)側(cè)腕部橫紋尺骨邊緣。三陰交穴：大鼠后肢內(nèi)踝尖直上10mm。

(2)電針操作：取0.35mm×25mm 無菌針灸針直刺雙側(cè)神門、三陰交穴3～5mm，連接G6805-2 型電針治療儀，選用連續(xù)波型，頻率10Hz，電壓6V，強度由小到大，以大鼠肢體出現(xiàn)抽動為度，留針20min。

1.4 取材

于電針結(jié)束后3h、6h、12h、24h 將對應(yīng)各小組處死，在枕骨大孔處迅速剪斷延髓，去顱骨，完全暴露腦組織，取出腦組織，在冰冷平皿上去大腦、小腦，分離出下丘腦后在冰冷生理鹽水中洗去血液稱重。

1.5 大鼠下丘腦5-HT、5-HIAA、NE 的測定

參照文獻[2]采用溶劑提取法提取標(biāo)本中5-HT、5-HIAA、NE，運用熒光分光光度計檢測其含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理方法

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 失眠大鼠模型復(fù)制及電針鎮(zhèn)靜催眠作用

本研究中正常大鼠在連續(xù)2d 腹腔注射PCPA 后，睡眠-覺醒的晝夜節(jié)律消失，說明模型復(fù)制成功。行為學(xué)表現(xiàn)為大鼠正常晝夜節(jié)律消失，活動明顯頻繁，白天也活動不停，興奮性增高，攻擊性增強。經(jīng)過電針治療后大鼠的睡眠-覺醒節(jié)律開始恢復(fù)，白天活動少，安靜、蜷臥、不易被外界驚醒，提示電針治療發(fā)揮了鎮(zhèn)靜催眠作用。

2.2 失眠大鼠單次電針后下丘腦5-HT、5-HIAA 及NE 的含量變化，詳見表1-表3。

表1 電針對PCPA 致失眠大鼠下丘腦5-HT 含量的影響(±S)

表1 電針對PCPA 致失眠大鼠下丘腦5-HT 含量的影響(±S)

注：與對照組比較，▲▲P<0.01；與模型組比較，★★P<0.01。

5-HT(ng/g)對照組 模型組 電針組3h 8 978.12±19.77 675.67±28.01 ▲▲ 795.72±33.59 ▲▲★★6h 8 915.52±31.58 623.79±30.28 ▲▲ 692.70±21.29 ▲▲★★12h 8 890.92±31.28 614.63±15.86 ▲▲ 672.22±12.76 ▲▲★★24h 8 970.48±48.59 643.57±20.94 ▲▲ 650.02±24.94 ▲▲組別 例數(shù)(n)

表2 電針對PCPA 致失眠大鼠下丘腦5-HIAA 含量的影響(±S)

表2 電針對PCPA 致失眠大鼠下丘腦5-HIAA 含量的影響(±S)

注：與對照組比較，▲▲P<0.01；與模型組比較，★★P<0.01。

5-HIAA(ng/g)對照組 模型組 電針組3h 8 399.42±18.08 258.46±14.08 ▲▲ 373.38±7.13 ▲▲★★6h 8 381.31±11.69 232.66±15.04 ▲▲ 323.01±17.72 ▲▲★★12h 8 356.43±11.14 229.85±10.30 ▲▲ 285.04±13.62 ▲▲★★24h 8 393.81±22.86 248.60±18.47 ▲▲ 259.33±14.17 ▲▲組別 例數(shù)(n)

表3 電針對PCPA 致失眠大鼠下丘腦NE 含量的影響(±S)

表3 電針對PCPA 致失眠大鼠下丘腦NE 含量的影響(±S)

注：與對照組比較，▲▲P<0.01；與模型組比較，★★P<0.01。

NE(ng/g)對照組 模型組 電針組3h 8 508.41±8.29 655.43±13.47 ▲▲ 548.46±23.57 ▲▲★★6h 8 534.86±18.00 631.93±14.24 ▲▲ 570.61±18.17 ▲▲★★12h 8 555.44±24.83 644.01±38.69 ▲▲ 608.56±14.48 ▲▲★★24h 8 511.32±9.22 647.62±14.80 ▲▲ 634.67±13.46 ▲▲組別 例數(shù)(n)

由表1、表2、表3可見，模型組各時間組5-HT、5-HIAA含量均低于對應(yīng)對照組、NE 含量均高于對應(yīng)對照組，差異具有顯著性(P<0.01)，說明腹腔注射PCPA 明顯降低大鼠下丘腦的5-HT、5-HIAA 含量、升高大鼠下丘腦的NE 含量。電針后3h、6h、12h 電針組5-HT、5-HIAA 含量均明顯高于對應(yīng)模型組(P<0.01)、NE 含量明顯低于對應(yīng)模型組(P<0.01)，電針后24h 與模型組比較無顯著差異(P>0.05)，說明電針治療顯著增加失眠大鼠下丘腦5-HT、5-HIAA 含量、降低NE 含量，且其效應(yīng)可持續(xù)12h 以上。電針組各時間組5-HT、5-HIAA 含量均低于、NE含量均高于對應(yīng)對照組，差異具有顯著性(P<0.01)，說明單次電針不能使失眠大鼠的5-HT、5-HIAA、NE 含量完全恢復(fù)到正常水平。

3 討論

睡眠-覺醒節(jié)律所涉及的神經(jīng)生理過程非常復(fù)雜。許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)[3,4]單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、5-HIAA、NE、DA 等參與睡眠機制的調(diào)節(jié)。5-HT 在睡眠的發(fā)生和維持中起著決定性作用。有研究發(fā)現(xiàn)[5]，給貓腹腔注射色氨酸羥化酶抑制劑PCPA能抑制5-HT 的生物合成，引起完全失眠。另有研究發(fā)現(xiàn)[6]，杏仁核注射5-HT 前體5-羥色氨酸(5-HTP)可使覺醒減少、慢波睡眠和快波睡眠增多、睡眠加深、入睡潛伏期縮短，提示杏仁核5-HT 有顯著的促進睡眠作用。5-HIAA 是5-HT 的代謝終產(chǎn)物，其變化也間接反映5-HT 的變化。故本實驗同時測定下丘腦中5-HT 及其代謝產(chǎn)物5-HIAA 的質(zhì)量分數(shù)來研究電針對PCPA 大鼠的影響。NE 作為腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上行激動系統(tǒng)的重要部分，主要與快速動眼相睡眠(REM)及覺醒的維持有關(guān)，并參與情感調(diào)節(jié)。有研究認為[7]，腦內(nèi)NE 質(zhì)量分數(shù)下降,可使其維持覺醒的功能降低，并減少對維持睡眠的5-HT 的抑制作用而改善睡眠。在本實驗中，經(jīng)電針神門、三陰交穴治療后大鼠失眠行為得到明顯改善，失眠大鼠下丘腦內(nèi)降低的5-HT、5-HIAA 含量明顯升高、升高的NE 含量明顯降低，且3h、6h、12h 電針組這三項指標(biāo)的含量與模型組比較差別均具有顯著性，提示電針可能是通過增加其腦內(nèi)5-HT 合成與代謝、降低NE 質(zhì)量分數(shù)，恢復(fù)5-HT 通路與NE 通路之間的相互制約和平衡，進而恢復(fù)正常的睡眠-覺醒節(jié)律，達到治療失眠的目的。

時間因素是影響針灸療效的一個重要方面。針灸效應(yīng)的發(fā)生發(fā)展與時間的關(guān)系，即為針灸作用的時間效應(yīng)[8]，指的是在對穴位進行針灸刺激后，其效應(yīng)的顯現(xiàn)有一個規(guī)律，即先經(jīng)過一段長短不一的潛伏期，然后針效才迅速上升，在高水平維持一段時間后，便逐漸下降回落至針前的水平。針刺作用的時效關(guān)系，包括針刺的最佳誘導(dǎo)期、針刺作用的半衰期、針刺作用的殘效期[9]。這種時效關(guān)系說明針灸效應(yīng)的作用時間是有限度的，這就提示在臨床實踐中，要想提高針灸的治療效果，就要注重針刺的最佳誘導(dǎo)期（最佳留針時間）以及針刺治療的間隔時間，以便針刺效應(yīng)有效蓄積起來，達到治愈疾病的目的。另有研究表明，針灸治療慢性失眠量效性非常重要，特別是針灸治療初期，只有量積累到一定程度，療效才能顯現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示單次電針并不能完全消除PCPA 的作用使失眠大鼠下丘腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)恢復(fù)到正常水平，這也提示了在臨床上治療失眠應(yīng)注意針灸治療量的積累，需要進行重復(fù)多次的針灸治療。針灸治療失眠癥既要求量的積累又受相對時間較短的針效半衰期的限制，本研究結(jié)果顯示電針對失眠大鼠下丘腦單胺類遞質(zhì)的效應(yīng)持續(xù)12h 以上，故建議在針效完全消失前給予第2 次針灸以達更好的治療效果。就本實驗研究而言，電針治療是在連續(xù)2d 腹腔注射PCPA 后達到完全失眠后進行的，正值失眠癥狀最明顯的時候，從治療失眠的量效積累和本研究顯示的針效延續(xù)時間結(jié)果，建議在失眠癥狀明顯期，為了提高和鞏固電針療效，臨床上可適當(dāng)間隔12h 左右給予第2 次電針治療，即給予每日兩次針灸治療。

[1] 任莉.不同穴位處方電針的催眠作用及其機理研究[D].廣州:暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文,2006.

[2] 徐淑云,卞如濂,陳修.藥理實驗方法學(xué)第三版[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:459-464.

[3] MALONEY K J,MA NVILLE L,JONES B E.Differential c-Fos expression in cholinergic,mono-aminergic,and GABA ergic cell groups of the pontom esencephalic tegmentum after paradoxical sleep deprivation and recovery[J].NeuroscI,1999,19(8):3057-3072.

[4] YOUNGBLOOD B D,SMAGIN G N,ELKINS P D.The effects of paradoxical sleep deprivation and valine on spatial learming and brain5-HT metabolism[J].Physiol Behav,1999,67(5):643-649.

[5] BORBELY A,NEUHAUSHU,TOBLER I.Effect of pchloropheny alanine and tryptophan on sleep,EEG and motor activity in therat[J].Behav Bra in Res,1981,2(1):1-22.

[6] 朱國慶.5-羥色胺和環(huán)磷酸腺苷對睡眠的影響[J].中國藥理學(xué)通報,1999,49(2):135-140.

[7] 江帆.與睡眠相關(guān)的中樞單胺類遞質(zhì)[J].國外醫(yī)學(xué):精神病學(xué)分冊,2001,28(1):55.

[8] 林文注,王佩.實驗針灸學(xué)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1999:116.

[9] 陳少宗.針刺作用時效關(guān)系研究的臨床意義[J].針灸臨床雜志,2008,24(6):1