金雀異黃素/殼聚糖微球的制備及其釋藥性能

馮淑瑩，李國(guó)明，侯 瓊，石 光

(華南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東廣州510006)

金雀異黃素(Genistein，其縮寫(xiě)Gen)是帶芳香A-環(huán)的三苯基抗癌癥的化合物(圖1)，其具有弱雌激素樣作用而又非雌激素類(lèi)，是一種強(qiáng)力的酪氨酸蛋白激酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑［1-3］．但是金雀異黃素水溶性很低，直接服用不利于人體吸收，降低了生物利用度，若采用高分子載體將其包裹，制成緩釋型藥物，并通過(guò)適當(dāng)方法把該緩釋藥物輸送到腫瘤部位，可顯著提高其生物利用度及藥物的藥效和降低毒副作用［4］．殼聚糖(CS)是一種優(yōu)良的天然高分子，具有良好的生物相容性和生物降解性，可利用其糖環(huán)上的胺基和羥基進(jìn)行交聯(lián)改性，并通過(guò)控制交聯(lián)度以控制交聯(lián)效果［5］．以殼聚糖為載體包裹金雀異黃素尚少見(jiàn)報(bào)道，本文以殼聚糖為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，采用乳化分散-化學(xué)交聯(lián)法制備出粒徑小，分散性好，藥物含量及藥物包封率較高的金雀異黃素/殼聚糖緩釋微球．

圖1 金雀異黃素結(jié)構(gòu)式Figure 1 Structure of genistein

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器和試劑

50型偏光顯微鏡(日本Nikon公司);IR Prestige-21型紅外光譜儀(日本Shimadzu公司)，KBr壓片;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司);ZEISSULTRA 55掃描電鏡(Carl Zeiss NTSGmbH，Germany);Y 2000型X射線(xiàn)衍射儀(丹東射線(xiàn)儀器有限公司)．

金雀異黃素(寶雞市方晟生物開(kāi)發(fā)有限公司)，質(zhì)量98%純;殼聚糖(玉環(huán)縣海洋生物化學(xué)有限公司)，脫乙酰度 91．18%，粘均分子量 4．76×105;戊二醛(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)，25%水溶液，生化試劑;透析袋，聚碳酸酯-聚醚嵌段共聚物材料，上海源聚生物科技有限公司;其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純．

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 金雀異黃素殼聚糖微球的制備 將CS溶于1%的醋酸溶液中，配制成CS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1．0%、1．5%、2．0%的 CS 醋酸溶液．待殼聚糖溶解后，按照m(金雀異黃素)∶m(殼聚糖)分別為1∶2、1∶3、1∶4的藥載比，稱(chēng)取金雀異黃素粉末，用乙醇溶解后加入到CS醋酸溶液中，經(jīng)攪拌均勻后靜置得金雀異黃素殼聚糖混合溶液．按一定的水油比，0．5 h內(nèi)逐滴滴加至含乳化劑的混合油相中(V(真空泵油)∶V(液體石蠟)=3∶1)，通過(guò)高速機(jī)械攪拌分散成W/O乳液．之后，按氨基與醛基的摩爾比分別為2∶1、1∶1、1∶2加入相應(yīng)量的戊二醛，在55℃下進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)分別為3、5、7 h，滴加 0．1 mol/L 的 NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH，繼續(xù)反應(yīng)2 h，然后停止攪拌．將產(chǎn)物離心分離，依次用石油醚和乙醇洗滌，抽濾，真空干燥．

1．2．2 粒徑分布和形態(tài)觀測(cè) 將干態(tài)載藥微球樣品均勻分散，經(jīng)噴金處理后在5 kV下用掃描電子顯微鏡觀察微球的形態(tài)．取一定質(zhì)量的微球，置于水中，超聲波分散，以激光粒度儀測(cè)量其粒徑分布［6］．

1．2．3 紅外光譜分析 用KBr與樣品研磨壓片，在4 000～400 cm-1掃描其吸光度．

1．2．4 X射線(xiàn)衍射 靶材選用CuKα，λ=0．015 417 8 nm，電壓 30 kV，電流 20 mA，掃描速率 0．03°/s，掃描范圍 2°≤2θ≤60°．

1．2．5 金雀異黃素含量測(cè)定工作曲線(xiàn)的繪制 參考文獻(xiàn)［7］，稱(chēng)取一定量金雀異黃素分別以無(wú)水乙醇、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液(pH 7．4)和檸檬酸-NaOH-鹽酸緩沖溶液(pH 3．9)為溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，其質(zhì)量濃度分別為 4、8、12、16、20、24 mg/L，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定金雀異黃素溶液在190～400 nm的紫外光譜圖，確定最佳的測(cè)量波長(zhǎng)為288 nm．選擇最佳波長(zhǎng)，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以吸光度(A)對(duì)藥物濃度(C)線(xiàn)性擬合曲線(xiàn)得回歸方程．

1．2．6 載藥量和包封率的測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取0．025 g的微球，先在超聲清洗器(功率1 000 W)中超聲破碎1 h，再運(yùn)用索氏抽提法，以無(wú)水乙醇為溶劑，在90℃下回流抽提72 h，使微球中金雀異黃素完全溶出．將提取液轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，定容．用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在288 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程求出金雀異黃素濃度，按下列公式計(jì)算微球的載藥量和包封率:

載藥量=(微球內(nèi)藥物質(zhì)量/微球的總質(zhì)量)×100%

包封率=(微球內(nèi)藥物含量/加入的藥物含量)×100%

1．2．7 體外釋放 準(zhǔn)確稱(chēng)取微球0．05 g，裝入透析袋中，密封，分別置于50 mL的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液(pH 7．4)和檸檬酸-NaOH-鹽酸緩沖溶液(pH 3．9)釋放介質(zhì)中，于(37 ±0．5)℃、100 r/min速率振蕩，定時(shí)取釋放介質(zhì)5 mL(同時(shí)補(bǔ)充等量同溫的釋放液)，測(cè)定吸光度，計(jì)算藥物濃度，并繪制累積釋藥率-時(shí)間曲線(xiàn)．累積釋藥率=(藥物釋放總量/藥物含量)×100%．

2 結(jié)果與討論

2．1 微球的理化性能和結(jié)構(gòu)表征

mcs∶mgen越大，包封率也越大(表 1)，這是由于Gen 用量一定時(shí)，mcs∶mgen越大，CS 的用量也越多，分子鏈骨架對(duì)Gen的屏蔽作用越大，有利于對(duì)藥物的包裹，因此包封率也隨之增大．

表1 藥載比對(duì)載藥量、包封率的影響Table 1 Effect ofmass ratioes of genistein on drug-loading rate and drug-encapsulating efficiency

微球球形圓整性好破損少，有部分團(tuán)聚，分散顆?；旧铣是蛐?，大部分微球粒徑在2～4μm(圖2)，更有部分納米級(jí)微球出現(xiàn)．經(jīng)激光粒度儀測(cè)定，其平均粒徑為13．25μm(圖3)，稍大于照片中看到的微球粒徑，這是部分微球團(tuán)聚所造成的．后處理時(shí)抽濾和干燥可能是造成微球分散性不夠理想和有少量微球變形的主要原因．

圖2 金雀異黃素/殼聚糖微球掃描電鏡圖(×11 830)Figure 2 SEM of genistein-chitosanmicrospheres

圖3 微球粒徑分布圖Figure 3 Particle diameter distribution of themicrospheres

CS的特征吸收峰出現(xiàn)在1 577 cm-1(—NH2的變形振動(dòng))(圖4)，1 408 cm-1(C═ N的伸縮振動(dòng))，1 155 cm-1(C— O— C的伸縮振動(dòng))．Gen的特征吸收峰出現(xiàn)在1 693 cm-1(C═ O伸縮振動(dòng))，1 504 cm-1(C═ C伸 縮 振 動(dòng))，1 361 cm-1(—CH2—彎曲振動(dòng)和C— O— C彎曲振動(dòng))．譜圖c為載藥微球的紅外吸收光譜圖，1 658 cm-1處出現(xiàn)了Gen中的C═ O伸縮振動(dòng)紅移的吸收峰，在1 030 cm-1處出現(xiàn)了Gen中的C═ C伸縮振動(dòng)紅移的吸收峰，3 700 cm-1處出現(xiàn)了Gen中—OH伸縮振動(dòng)紅移的吸收峰，這些結(jié)果證明Gen與CS之間產(chǎn)生了比較強(qiáng)的分子間相互作用力［8］．

圖4 各樣品的紅外光譜圖Figure 4 IR spectra of the samples

圖5 各樣品的XRD圖Figure 5 XRD pattems of samples

2．2 體外釋藥的影響因素

2．2．1 純藥與微球在透析袋中的釋放情況 金雀異黃素藥物在5 h內(nèi)就釋放了45%到透析袋外面(圖6)，而金雀異黃素/殼聚糖微球在15 h釋放了約10%，20 h以后釋放速率增加緩慢，說(shuō)明金雀異黃素/殼聚糖微球具有良好的緩釋性能．

2．2．2 藥載比的影響 CS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，改變金雀異黃素與殼聚糖的比例(分別為 1∶2、1∶3、1∶4)，制得的微球在堿性緩沖溶液中釋放如圖7所示．可以看出，釋藥速率隨投料比的減少而減少，這是由于微球外壁增厚所致．投料比減少，微球外壁材料對(duì)藥物的濃度增大，并增大了分子鏈堆積密度，導(dǎo)致釋藥速率降低［9］．

圖6 金雀異黃素與載藥微球在pH 7．4緩沖溶液中的釋放曲線(xiàn)Figure 6 Drug-releasing curves ofgenistein andmicrospheres at pH 7．4

圖7 不同藥載比的釋放曲線(xiàn)Figure 7 Drug-releasing curves of themicrospheres with different mass ratios of genistein to CS m(genistein)∶m(CS)

2．2．3 交聯(lián)反應(yīng) pH的影響 CS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1．5%，藥載比為1∶4，改變交聯(lián)反應(yīng)時(shí)的 pH，制得的微球在弱堿緩沖溶液中的釋放如圖8．可以看出，在緩沖溶液中，隨著交聯(lián)時(shí)的pH減少，所得微球的藥物釋放速率降低．因?yàn)镃S在pH較低的條件下，高分子鏈處于較為伸展的狀態(tài)，更有利于CS分子鏈之間交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，使交聯(lián)橋分布更均勻，交聯(lián)度更高，因而使藥物釋放速率減慢．

2．2．4 釋放介質(zhì)pH的影響 圖9為CS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，藥載比為1∶3，交聯(lián)反應(yīng)時(shí)的pH為9所制得的微球在2種緩沖溶液中的釋放曲線(xiàn)，從圖中可以看到釋放性能受釋放介質(zhì)pH的影響明顯．在pH 3．9的檸檬酸-NaOH-鹽酸緩沖溶液中，微球的釋藥速率較大，因?yàn)樵诖谁h(huán)境中，CS有一定程度的溶脹，在堿性介質(zhì)中，雖然藥物的溶解性較在酸性介質(zhì)中大，但CS的溶脹效果不好，導(dǎo)致藥物釋放緩慢，因此藥物在酸性緩沖溶液中的釋藥速率較大［9］．

圖8 不同pH反應(yīng)條件下微球的釋藥曲線(xiàn)Figure 8 Drug-releasing curves of themicrospheres crosslinked at different pH

圖9 不同pH介質(zhì)中微球的釋藥曲線(xiàn)Figure 9 Drug-releasing curves of themicrospheres in different pH media

3 結(jié)論

運(yùn)用乳化-化學(xué)交聯(lián)法，以戊二醛為交聯(lián)劑，優(yōu)化了金雀異黃素-殼聚糖微球的制備條件，所得微球球形規(guī)整，平均粒徑 2 ～4 μm，在 mcs∶mgen為4∶1，CS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，反應(yīng)介質(zhì)pH 11的條件下所得微球載藥量為10．5%，包封率達(dá)52．5%，成球后藥物結(jié)晶度降低．對(duì)微球進(jìn)行體外模擬藥物釋放實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，微球緩釋性能良好，受載體質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響，在酸性介質(zhì)中釋藥速率比在堿性介質(zhì)中快．

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