體外蛋白質(zhì)復(fù)性方法及小分子添加劑在復(fù)性過程中的作用

余秀娟，趙麗艷，張曉光

（1.河北北方學院藥學系，河北 張家口 075000；2.中國特種設(shè)備檢測研究院，北京 100013）

1 引 言

蛋白質(zhì)是維持生命體正常進行的必不可少的物質(zhì)，也是生命遺傳的第二代密碼。蛋白質(zhì)的復(fù)性或折疊問題是生命科學研究中的核心問題之一，蛋白質(zhì)從它的變性狀態(tài)轉(zhuǎn)變到它特定的生物學天然構(gòu)象稱為蛋白質(zhì)復(fù)性，這個過程并不復(fù)雜。但是，一直以來將變性蛋白質(zhì)恢復(fù)其天然的活性構(gòu)象卻是一項很艱難的工作。

到目前為止，已發(fā)展了各種體外輔助蛋白復(fù)性方法。在眾多體外輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的方法中，蛋白折疊液相色譜 （protein folding liquid chromatography，PFLC）法獲得了長足的發(fā)展。與通常的液相色譜技術(shù)不同，PFLC除了能在色譜柱上將目標蛋白與其它組分分開，還能在色譜柱上進行變性蛋白折疊，并且易于放大、耗時較少、容易實現(xiàn)自動化。尤其是蛋白折疊疏水色譜法具有分離條件溫和、蛋白質(zhì)的活性回收率高、色譜柱較便宜以及可用于制備規(guī)模的優(yōu)點，是一種較為理想和具有發(fā)展?jié)摿Φ陌w蛋白的復(fù)性及同時純化色譜方法。

研究表明，在生物體細胞內(nèi)輔助蛋白質(zhì)順利完成折疊的添加劑有二硫鍵異構(gòu)酶、分子伴侶等。受生物體內(nèi)輔助蛋白質(zhì)指導新生多肽鏈進行正確折疊的啟發(fā)，多種輔助因子如聚乙二醇 （PEG）、精氨酸、組氨酸等也因其作用類似于 “分子伴侶”而成為體外輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的小分子添加劑，還有低濃度的變性劑、氧化還原試劑對 （GSH／GSSG）等添加劑均具有促進蛋白質(zhì)復(fù)性的作用［1，2］。但是，仍然有很多蛋白質(zhì)折疊過程中無法解決的障礙存在，如蛋白質(zhì)分子間因疏水作用而引起的聚集、半胱氨酸錯誤配對而形成二硫鍵連接的問題。尤其是由大腸桿菌 （E.coli）表達的包涵體蛋白質(zhì)，仍然需要研究和發(fā)展不同的復(fù)性機制來克服或減少這些障礙［3］。因此，可以通過先進的實驗手段捕捉變性蛋白質(zhì)向其活性結(jié)構(gòu)折疊過程的差異性變化規(guī)律，來獲得發(fā)生在蛋白質(zhì)復(fù)性過程中構(gòu)象變化的更加詳細的信息。

2 變性蛋白質(zhì)的來源

目前，基因工程技術(shù)的發(fā)展和蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)的多樣性已經(jīng)為利用微生物大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物和功能蛋白質(zhì)產(chǎn)品開辟了廣闊的空間，人們可以自由地根據(jù)蛋白質(zhì)的用途在體外來選擇基因表達系統(tǒng)獲得重組的目標蛋白。但是，在E.coli中表達的重組蛋白90%以上都形成了難溶性的聚集體，即包涵體［3］。這些聚集體是不具有生物活性和利用價值的，必須將它們恢復(fù)生物活性［4］。將其恢復(fù)生物活性需進行必要的步驟，即包涵體回收和溶解。

包涵體的回收是蛋白質(zhì)復(fù)性的首要步驟，根據(jù)實驗作用方法及要求的不同，已有了多種細胞的破碎方法。這些細胞破碎的方法大致可分為兩大類：機械法和非機械法。傳統(tǒng)的機械法包括了超聲、壓榨、研磨、勻漿等；通常的非機械法包括了化學法、滲透法、凍融法以及酶溶法等［5］。近年來，也發(fā)展了一些新的方法，如冷凍噴射、激光破碎、相向流撞擊等。目前，所用的方法都有其各自的優(yōu)點及適用范圍，要準確選擇適當?shù)姆椒ū仨氂欣碚撝R和實踐經(jīng)驗作為指導。例如，如果是用作蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能的研究，所選擇的方法必須不能影響目標蛋白質(zhì)的復(fù)性效果。

超聲破碎法［6］是實驗室常用的一種細胞破碎法。超聲波在少量樣品的處理使用中操作簡便、破碎液的損失較少，在實驗室的使用很常見。酶溶法［7］是一種利用生物酶將細胞的細胞壁及細胞膜進行消化溶解。采用酶溶法來處理實驗細胞，要根據(jù)細胞的結(jié)構(gòu)以及化學組成來選擇合適的酶。采用酶溶法時應(yīng)注意溫度、酶的用量、溶液的酸堿度以及時間等的控制和把握。有些化學試劑可以改變細胞壁和細胞膜的通透性，這些化學試劑可使細胞內(nèi)的物質(zhì)有選擇地滲透出來，這就是化學滲透法［8］，常用于處理培養(yǎng)的動物細胞。

在大腸桿菌中高水平表達形成的包涵體，由于其不溶性和致密性，大多數(shù)通過超聲破碎法以及離心處理就能相對容易與細胞的其他成分分離純化，這是包涵體的一個很重要的特點。粗純化的包涵體蛋白很穩(wěn)定，只有在高濃度的變性劑8mol／L脲或6～7mol／L的鹽酸胍溶液中才能充分溶解。溶解的包涵體蛋白得到了完全的變性，這時除了其一級結(jié)構(gòu)和共價鍵保留，其它的疏水鍵、氫鍵已經(jīng)完全破壞了，疏水的側(cè)鏈已完全暴露。若包涵體蛋白含有較多的二硫鍵，可能會產(chǎn)生肽鏈間和肽鏈內(nèi)的錯誤搭配。通常在這樣的情況下，采用在復(fù)性前向緩沖液中添加一定濃度的還原劑 （如β－巰基乙醇、二硫蘇糖醇等）來打開這些二硫鍵，復(fù)性過程中加入氧化劑 （如谷胱甘肽）促進二硫鍵的正確形成［9］。根據(jù)不同的蛋白質(zhì)選擇合適的增溶劑是非常重要的，是能否獲得高折疊產(chǎn)率蛋白質(zhì)的關(guān)鍵步驟［10］。

3 體外輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的方法

蛋白質(zhì)折疊是重組蛋白質(zhì)大規(guī)模復(fù)性的關(guān)鍵步驟［11］。目前，變性蛋白質(zhì)體外復(fù)性的方法主要有傳統(tǒng)的輔助復(fù)性法，如稀釋法、透析法［12］、超濾法［13］以及新發(fā)展的液相色譜 （LC）法或稱為蛋白質(zhì)折疊液相色譜法 （PFLC），也有在此基礎(chǔ)上模擬體內(nèi)分子伴侶、折疊酶、人工分子伴侶、反膠束的輔助復(fù)性方法。

3.1 體外輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的傳統(tǒng)方法

稀釋法、透析法和超濾法是蛋白質(zhì)在溶液中直接進行體外蛋白復(fù)性的方法。其中稀釋法是最簡單、使用頻率最高的蛋白質(zhì)復(fù)性方法。通過加入復(fù)性緩沖液直接的、高倍數(shù)的降低變性劑濃度，為蛋白質(zhì)提供折疊環(huán)境?？梢哉f無論是利用模型標準蛋白來研究變性蛋白質(zhì)的復(fù)性，還是對于重組的包涵體蛋白復(fù)性的研究，稀釋法都是首選的方法。蛋白質(zhì)折疊是分子內(nèi)的一級反應(yīng)過程，而聚集體的生成則為二級以上的反應(yīng)過程。蛋白質(zhì)的濃度的降低有利于提高蛋白質(zhì)復(fù)性回收率，而當變性劑的濃度降低到一定程度時，一些抑制劑會失去抑制蛋白聚集的作用，從而導致蛋白重新聚集［14］。所以稀釋復(fù)性過程中，稀釋倍數(shù)也是一個非常關(guān)鍵的參數(shù)。但是，在稀釋法復(fù)性過程中，稀釋體積大比例的增加為復(fù)性蛋白的后處理帶來了困難，通常導致回收率較低。

透析法［15］是利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過半透膜，而大分子物質(zhì)不能通過半透膜的性質(zhì)，達到分離效果的方法。在蛋白質(zhì)復(fù)性中可借助于蛋白質(zhì)分離的同時，在去除溶液中分子量小的雜質(zhì)而達到復(fù)性的目的。此法缺點是循環(huán)費時，且在膜內(nèi)目標蛋白仍會形成沉淀而聚集，常被用于其它復(fù)性方法之后小分子物質(zhì)去除。

超濾法是一種膜濾法，它以多孔的薄膜作為介質(zhì)，利用薄膜兩側(cè)的壓力差來分離溶液中不同分子量的物質(zhì)。

稀釋法和透析法是常用于實驗室小量蛋白復(fù)性研究的兩種方法。

3.2 體外輔助蛋白質(zhì)復(fù)性液相色譜法

綜上所述，且有實驗證實，利用傳統(tǒng)的稀釋法和透析法進行一些聚集態(tài)包涵體蛋白的復(fù)性是非常困難的［11］。近年來，PFLC在蛋白復(fù)性的多種方法中得到了長足的發(fā)展，已經(jīng)被作為蛋白質(zhì)復(fù)性與同時純化的一種重要手段［16］。目前，用于蛋白質(zhì)復(fù)性的PFLC法主要有疏水相互作用色譜 （HIC）、離子交換色譜（IEC）、親合色譜 （AFC）以及尺寸排阻色譜 （SEC）法［17］。

3.2.1 HIC

HIC是利用樣品各組分與填料之間的不同疏水作用來進行分離的一種方法，是蛋白質(zhì)折疊的一種重要方法［18］。HIC能吸附變性蛋白質(zhì)的疏水位點，其中包括HIC柱為變性蛋白質(zhì)的吸附和洗脫提供適合的折疊環(huán)境及分離純化折疊緩沖區(qū)中的混合物。使用HIC分離復(fù)性蛋白質(zhì)的優(yōu)勢在于不僅可以獲得高的折疊產(chǎn)量而且可以得到高純度的目標產(chǎn)物。采用HIC復(fù)性重組人干擾素的折疊產(chǎn)量是普通稀釋法的兩倍［19］。2004年，Geng XD等［20］將HIC用于rhIFN－γ復(fù)性與同時純化，發(fā)展了工業(yè)規(guī)模的HIC復(fù)性與純化，方法是基于化學平衡和分子間的相互作用的原理。當溶解于7.0mol／L鹽酸胍的rhIFN－γ直接以100mL／min的流速在HIC介質(zhì)的色譜柱洗脫后，目標蛋白的純度可達95.0%，比活為8.0×107IU／mg。實驗也證實了采用HIC復(fù)性rhIFN－γ的折疊產(chǎn)量是普通稀釋方法的62倍。

利用HIC復(fù)性蛋白質(zhì)來增加復(fù)性效率比其它方法更加有效，這是因為疏水介質(zhì)和未折疊的或不完全折疊的蛋白聚集體的疏水作用阻止了分子間的相互作用［19］。由于蛋白質(zhì)的折疊過程主要是疏水殘基之間的相互作用，蛋白質(zhì)折疊的過程取決于分子間的疏水作用力，所以實驗中HIC介質(zhì)的選擇是非常重要的［21，22］。Li JJ等［23，24］的報道中提到，利用疏水作用力強的配基會導致蛋白質(zhì)的錯誤折疊。但HIC法的優(yōu)點是可以通過調(diào)節(jié)緩沖液的成份及比例，改變蛋白質(zhì)與基質(zhì)間的疏水作用力。當在折疊緩沖液中加入丙三醇和脲時，緩和了疏水作用力同時可以促進蛋白質(zhì)復(fù)性和提高蛋白質(zhì)的折疊效率［20］。實驗結(jié)果顯示，當折疊緩沖液中存在50% （v／v）丙三醇和脲時，用HIC柱洗脫未折疊的Lys，可獲得的蛋白質(zhì)復(fù)性質(zhì)量回收率為85.0%，活性產(chǎn)量為86.3%。當折疊緩沖液中沒有添加丙三醇時，獲得的活性產(chǎn)量僅為50.9%。

一些研究也表明了，影響HIC柱折疊病毒蛋白質(zhì)的因素還包括流動相的鹽類、pH值和梯度洗脫的模式。Wang CZ等［25］研究了重組朊蛋白的HIC復(fù)性與純化，通過優(yōu)化固定相、流動相 （pH值、鹽類）以及梯度洗脫模式的影響因素，可使蛋白質(zhì)復(fù)性質(zhì)量回收率達到87.0%，純度為96.0%。Wang F等［26］嘗試用HIC法復(fù)性干擾素，通過減小鹽酸胍的濃度增加聚乙二醇的濃度，用臺階式梯度洗脫法成功地完成了干擾素柱上折疊，并與稀釋法比較，此法在聚乙二醇的存在情況下使蛋白質(zhì)的復(fù)性質(zhì)量回收率增加了30.0%，活性回收率是稀釋法的2.6倍。所以，流動相的組成、洗脫模式以及流速是HIC法蛋白質(zhì)復(fù)性重要的影響因素，在實驗中要把握好這些條件的選擇。因此，HIC具有分離條件溫和、分辨率高、負載量大、復(fù)性蛋白質(zhì)的活性回收率及純度高的優(yōu)點，是蛋白質(zhì)復(fù)性最常用的方法之一。近年來，隨著HIC柱固定相介質(zhì)種類研發(fā)，可采用的HIC復(fù)性與純化的蛋白質(zhì)種類增多，使HIC法得到了迅速的發(fā)展。

3.2.2 IEC

IEC是利用離子交換劑與溶液中的離子發(fā)生相互交換反應(yīng)進行分離的方法。離子交換劑是一種固體狀的多孔顆粒，可在水溶液中浸濕和溶脹。這些多孔顆粒表面有許多可電離的基團，當其在水中電離時，其中有一種離子可在水中自由移動，而另外有一種卻在固定相上不能自由移動。這些可自由移動的離子能被同類的其它離子置換，即為離子交換。IEC以離子交換劑為固定相，以含特定離子的溶液作流動相，利用離子交換劑上可交換的離子與溶液中的離子發(fā)生交換作用。

IEC復(fù)性法是利用被分離的蛋白質(zhì)與色譜介質(zhì)的結(jié)合，使變性的被分離蛋白與色譜介質(zhì)結(jié)合而減少互相凝集，隨著流動相成分的改變，結(jié)合于色譜介質(zhì)的變性蛋白質(zhì)被洗脫，在發(fā)生復(fù)性的同時因色譜的作用也被同時純化［27］。在研究采用IEC進行蛋白質(zhì)復(fù)性時，很多實驗結(jié)果顯示，色譜條件流速、進樣量、流動相中的pH值、添加劑脲的濃度以及谷胱甘肽的氧化率都是影響復(fù)性效率的主要因素，其合適條件的選擇均可以促進蛋白質(zhì)的柱上折疊。Wang CZ等［28］報道了在最優(yōu)化條件下復(fù)性與同時純化重組人粒細胞集落刺激因子 （rhG-CSF），可使rhG-CSF復(fù)性產(chǎn)物質(zhì)量回收率達到49.0%，純度為96.0%，比活為3.0×108IU／mg。因此，用于IEC法復(fù)性與同時純化變性蛋白，其最優(yōu)化色譜條件和添加合適的添加劑均能提高蛋白質(zhì)復(fù)性的效率。當然，針對不同的變性蛋白質(zhì)需要進行最優(yōu)化工藝的研究。Bai Q等［29］報道了用IEC法復(fù)性與同時純化重組人白巨噬細胞集落因子 （rhGM-CSF），通過優(yōu)化流動相的pH值、脲濃度以及GSH／GSSG的比例，獲得目標蛋白的復(fù)性產(chǎn)率為58.8%，純度為96.2%，實驗得到的蛋白比活為1.66×107IU／mg，在流動相中添加合適配比的GSH／GSSG可促進二硫鍵的形成，增加目標蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。還有一些其它的條件如變性蛋白的濃度、流動相中鹽的離子強度、溫度等，這些都是IEC柱上復(fù)性的重要因素。還有一個重要的因素是緩沖液的離子強度，如半胱氨酸的基團可能與蛋白質(zhì)之間的靜電作用有關(guān)［30］。如果流動相中的pH值遠離蛋白質(zhì)的等電點，可以減少錯誤折疊和聚集形式蛋白的生成幾率［31，32］。IEC介質(zhì)在的蛋白質(zhì)折疊過程中也起到了關(guān)鍵性的作用，合理選擇陽離子還是陰離子介質(zhì)可對蛋白復(fù)性效率的提高起到積極的輔助作用。近年來，為了提高IEC對蛋白質(zhì)的復(fù)性效率，發(fā)展了許多增加復(fù)性產(chǎn)量和減少成本的IEC的有效復(fù)性方法。Jin T等［33］報道了用IEC法進行脲濃度梯度變化折疊重組人干擾素-γ并獲得了成功，復(fù)性的產(chǎn)率達到54%，比活為7.5×105IU／mg。同樣的方法用于牛血清蛋白 （BSA）也取得了成功，折疊產(chǎn)率可到55%。因此，IEC法是用于蛋白質(zhì)復(fù)性，尤其是多種包涵體蛋白質(zhì)柱上復(fù)性有力的工具。

3.2.3 SEC

SEC法，又稱分子篩色譜法。它是一種溶質(zhì)與固定相或流動相之間均無相互作用的一種蛋白分離方法。其原理主要是根據(jù)分子的尺寸大小差異分離的，即其固定相 （多孔凝膠）能有效地進行分子量大小不同的蛋白質(zhì)的分離。

基于蛋白分子的大小和其分子量分布范圍大的條件，對一個天然態(tài)完整的球型蛋白，通過多孔填料的SEC柱時，孔大小與分離的蛋白大小相似是至關(guān)重要的，SEC可用于未知成份的樣品的不同分子量大小的 “組分離”。通常的情況下，由于理想的SEC法中分子量大的蛋白質(zhì)在某種意義上與SEC固定相之間不存在任何相互作用即可達到分離的目的。因此，SEC只作為一種蛋白的粗分離方法。

同樣，在采用SEC復(fù)性蛋白時，除了選擇合適的色譜固定相和流動相外，流動相的流速和進樣量的優(yōu)化也是非常重要的。Wang CZ等［34］研究表明，增加流動相的流速可以減少聚集，而低的流速使蛋白質(zhì)有較長的折疊時間。合適的進樣量可以提高高濃度蛋白質(zhì)的折疊效率，已有研究報道了色譜的進樣量一般為柱體積的2%～4%，一般不超過5%［35］。此外，還有通過優(yōu)化流動相的pH值、脲濃度、氧化還原環(huán)境等來提高蛋白質(zhì)的折疊產(chǎn)率。Ejima等［36］在流動相中添加了0.2mol／L～0.75mol／L精氨酸來復(fù)性鼠單克隆抗體和重組白介素-6、堿性成纖維細胞生長因子和干擾素－γ。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動相中精氨酸的存在能減小固定相與蛋白質(zhì)間的選擇性相互作用，提高了蛋白質(zhì)復(fù)性的質(zhì)量回收率。

3.2.4 AFC

AFC法分離蛋白質(zhì)的原理是基于蛋白質(zhì)與AFC固定相之間的高選擇性和專一性的作用。很多生物大分子具有與其結(jié)構(gòu)對應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特性，如：抗原和抗體、蛋白酶與輔酶、核糖核酸與其互補的脫氧核糖核酸等體系、激素與其受體，都具有這種特性，生物大分子間的這種專一的結(jié)合能力稱為親和力。Lichty等［37］的綜述中列出了多種蛋白質(zhì)與AFC固定相之間的選擇性和特異性的作用。

Katoh等［38］采用AFC復(fù)性碳酸酐酶。將與碳酸酐酶相應(yīng)的抗體鍵合裝柱，使變性的碳酸酐酶經(jīng)過色譜柱，將蛋白質(zhì)進行折疊復(fù)性獲得較高的復(fù)性產(chǎn)率。用AFC法復(fù)性與純化重組蛋白一步就可以達到較高的純度［39］，從而減少了變性蛋白質(zhì)復(fù)性過程中的損失。根據(jù)配基不同，常用的有固定化金屬親和色譜（IMAC）和免疫親和色譜法。IMAC金屬離子作為一種螯合劑鍵合在色譜固定相上，常常被用于含二硫鍵的重組蛋白質(zhì)的復(fù)性與純化的研究，特別是含組氨酸 （His）的重組蛋白。通過在重組蛋白質(zhì)復(fù)性中引進His標記后，可進一步利用對His的選擇性進行復(fù)性與純化。

大量合成帶有特異性純化標簽的融合蛋白被廣泛使用，使得蛋白折疊與純化變得更為容易。Li M等［39］采用IMAC一步復(fù)性在大腸桿菌中表達的包含有六個組氨酸標簽的重組人IFN-λ1，其含有Ni2＋-次氮基三乙酸瓊脂糖，獲得了純度達95.0%的高產(chǎn)率。Shi ZX等［40］比較不同方法復(fù)性與純化帶有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶標簽的重組人Delta-like1蛋白也發(fā)現(xiàn)了，利用一步GSTrap HP親合色譜柱復(fù)性目標蛋白可獲得的最高純度達95.0%。

相對于IMAC，免疫親和色譜具有更高的選擇性，利用了一種可專一性結(jié)合靶體的蛋白質(zhì)，典型的抗體與相應(yīng)的抗原就是例子。以蛋白A為基礎(chǔ)的AFC是一種常用的方法，蛋白A-AFC的特殊用途是以高特異性方法捕獲抗體。然而，AFC柱制備成本高，不易規(guī)?；?。近年來，在AFC柱的成本降低方面取得了大的進展，Yasuda等［41］采用刀豆蛋白A （Con A）-瓊脂糖和固定化硫代α－半乳糖苷瓊脂糖 （thio-Gal）AFC柱快速有效的純化重組人α-Gal A，獲得的質(zhì)量回收率為62.0%。由于AFC法具有的高選擇性，現(xiàn)也已經(jīng)發(fā)展為一種非常實用的蛋白質(zhì)復(fù)性與純化工具。

4 小分子添加劑在蛋白體外復(fù)性中的作用

如上所述，各類的體外輔助蛋白質(zhì)復(fù)性技術(shù)都能不同程度地促使蛋白質(zhì)復(fù)性，但是蛋白質(zhì)復(fù)性效率的提高仍然是個難點。當?shù)鞍踪|(zhì)在體外復(fù)性時，蛋白質(zhì)復(fù)性效率實際上取決于正確折疊過程與聚集過程之間的競爭，即天然活性蛋白質(zhì)形成與聚集體的形成之間的競爭［42］。聚集體的形成常常被認為是有一個 “熔球態(tài)”的中間態(tài)，它的形成是由于疏水基團的暴露，使其自身容易發(fā)生聚集的結(jié)果［43］。為此發(fā)展一些不同添加劑復(fù)性的方法，可以通過添加一些小分子促進劑來輔助蛋白質(zhì)折疊，抑制聚集體的形成。其主要以促進蛋白質(zhì)折疊過程中正確的天然結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、促進折疊中間產(chǎn)物的溶解性以及減少錯誤折疊復(fù)性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性為目的。小分子添加劑有以下6類：①表面活性劑或去垢劑：早期用3-（3-膽胺丙基）二甲氨基-1-丙磺酸 （CHAPS）、Trition X-100、磷脂、脫氧膽酸鈉等一類小分子作為添加劑。實驗的結(jié)果顯示，這類小分子試劑在一定程度上可以促進蛋白質(zhì)的折疊，但是，其中有一個需要克服的困難是其與蛋白結(jié)合后很難除去；②助溶劑：聚乙二醇系列 （PEG 6 000～20 000）。添加此類小分子，可以與蛋白折疊的中間產(chǎn)物特異結(jié)合，形成非聚集形式的化合物，同時這些化合物的存在大大減少了蛋白分子之間的結(jié)合機會，從而更進一步地減少蛋白聚集形式的形成。③氧化還原劑：若目標蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中含有二硫鍵，則在蛋白折疊時需加入適量的氧化還原劑，從而促進蛋白質(zhì)中二硫鍵的正確對接。常用的氧化還原劑有GSH／GSSG、DTT以及β－巰基乙醇等［1］。④蛋白質(zhì)促進劑：模擬體內(nèi)折疊酶的一類可以協(xié)助細胞內(nèi)新生的肽鏈折疊成具有活性的蛋白質(zhì)的酶，可以催化與蛋白質(zhì)折疊必需的直接相關(guān)的共價反應(yīng)。如肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶。分子伴侶的作用是可以與蛋白質(zhì)結(jié)合且可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的構(gòu)象，并且利于新生的多肽鏈的折疊［44］。⑤人工伴侶：除了人工合成的分子伴侶外，還有一類類似人工伴侶的小分子環(huán)糊精、脂質(zhì)體等可作為添加劑促進變性蛋白正確的折疊。⑥其它添加劑：一定濃度的L－精氨酸可以破壞錯誤折疊的蛋白以及錯誤對接的二硫鍵的穩(wěn)定性，而有利于蛋白的正確折疊。甘油的添加也能提高復(fù)性液的黏度，降低分子碰撞和錯誤的蛋白結(jié)合的幾率，從而提高折疊效率。此外，還有一些小分子的添加劑如脲、鹽酸胍以及一些金屬離子的添加 （Mg2＋、Cu2＋）等，在一定程度上都到可以抑制蛋白的聚集，起到提蛋白折疊產(chǎn)率的作用。

目前，稀釋添加法和色譜柱添加劑的使用均能很好地促進蛋白質(zhì)復(fù)性，提高蛋白復(fù)性的效率。其中鹽酸胍、脲、L-精氨酸以及氧化還原劑是常用于實驗室中蛋白折疊的輔助劑［45］，然而它們的作用卻是 “雙刃刀”，低濃度時可以抑制蛋白聚集促進蛋白折疊，高濃度卻能使蛋白變性。因此，合理地在溶液復(fù)性和柱上復(fù)性過程中添加小分子試劑是至關(guān)重要的。

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