一種簡單高效的水稻體細胞誘變育種新方法＊

林建中，楊遠柱，周 波，符辰建，杜長青，胡小淳，唐冬英，趙小英，史江偉，朱詠華，劉選明?

（1.湖南大學 生物學院，植物功能基因組學與發(fā)育調控湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410082；2.湖南亞華種業(yè)科學研究院，湖南 長沙 410001）

水稻（Oryza sativa L.）是世界上重要的經(jīng)濟谷類作物，有超過一半的世界人口以大米作為主食.然而，隨著人口的不斷增長和耕地的減少，據(jù)估計到2030年大米的需求將比現(xiàn)在提高40%[1].因此，很有必要通過各種育種方法以提高水稻產(chǎn)量.

育種是一個從大量株系中篩選出理想表型株系的過程，這些大量的株系一般來源于自然和人工突變以及雜交重組.因突變可能產(chǎn)生的優(yōu)良種質是育種的一個重要來源.多樣化的種質資源對水稻育種非常重要，如提高產(chǎn)量以及其他農(nóng)藝性狀的改良等[2－3].然而，優(yōu)良品種的篩選需要大量原始育種材料，因而采用新的方法來獲得大量多樣化的候選株系就顯得非常重要.體細胞無性系變異作為一個新的變異來源，引起了遺傳學家和育種學家的大量關注[4].許多作物包括玉米和水稻[5]等已被用于組織培養(yǎng)和體細胞無性系變異研究[5－7]，為作物育種提供了一種新的誘變途徑.體細胞的誘導突變能夠獲得相當豐富的遺傳變異，又因其容易應用和推廣而具有很高的實用價值[8－9].突變體因染色體數(shù)目改變、點突變、結構性染色體重排等原因而引起表型改變，而且該表型還可以穩(wěn)定遺傳.因此，以此為基礎可以培育新的作物優(yōu)良品種.

體外培養(yǎng)誘導突變所涉及的因素包括培養(yǎng)基的成分（各種鹽類、激素和有機物質等）和培養(yǎng)條件（溫度、光照和培養(yǎng)時間等）[10].誘變造成組織培養(yǎng)細胞的突變可能是一個或多個誘變因素.迄今，在水稻誘變育種方面還未見以高濃度2，4－D為誘變劑的誘變育種方法的報道.在本研究中，我們分別研究了繼代培養(yǎng)時間、2，4－D濃度和不同外植體對突變頻率的影響，建立了一種以幼穗為外植體和4.0mg／L 2，4－D誘變處理的水稻體細胞無性系誘變育種方法.同時，利用該誘變方法從水稻品種株1S和中9B中分別成功選育了2個穩(wěn)定的優(yōu)良矮稈突變株系SV14S和SV9B，并進一步證實了該水稻體細胞誘變育種方法的有效性.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用的植物材料為4個秈稻品種株1S，中9B，316B和R527，均為華南地區(qū)的雜交水稻骨干親本.株1S為湖南省株州市農(nóng)科所培育的秈型光溫敏核不育水稻[11]，中9B和316B是優(yōu)良三系保持系，而R527是一種優(yōu)良的恢復系.

株1S用于進行各種誘變因素的優(yōu)化實驗.當最優(yōu)誘變體系建立后，中9B，316B和R527用于后續(xù)的誘變育種實驗，用以對該誘變方法加以驗證.

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

選用MS為基本培養(yǎng)基[12]，蔗糖濃度為3.0%，用0.8%的瓊脂或0.4%植物凝集素固化，pH 為5.8～6.0，在121℃濕熱高壓滅菌20min，不同發(fā)育階段添加不同的激素（見表1）.培養(yǎng)溫度為25±1℃，光照強度為2 000lx，光照時間為12h光照／12h黑暗.

表1 培養(yǎng)基類型與成分Tab.1 The category and components of medium

1.2.2 外植體的獲取和愈傷組織的誘導

幼穗采集自水稻花粉母細胞形成時期，約2～3 cm長，與外面包裹的2層葉鞘一并采集.采集的幼穗可以在4℃冰箱中保存7d.將幼穗外層葉片剝去，保留旗葉鞘，置于70%酒精中浸泡1min，再置于10%NaClO中表面消毒10min.于超凈工作臺用無菌水沖洗4～5次，除去包裹著的旗葉鞘，將幼穗切成1cm左右的小段，接種于誘導培養(yǎng)基中以獲得愈傷組織（圖1（a））.幼胚采集自水稻受精后10～15d的幼嫩種子，其表面消毒過程與幼穗一樣.于超凈工作臺用鑷子將幼胚從穎殼內擠壓出來，然后接種在誘導培養(yǎng)基中以獲得愈傷組織.成熟胚來自除去穎殼的成熟種子，其表面消毒過程與幼穗一樣.最后將除去穎殼的成熟種子接種于誘導培養(yǎng)基中以獲得愈傷組織.

圖1 水稻體細胞無性系誘變程序Fig.1 The procedure of somatic mutagenesis

1.2.3 繼代時間對植株再生的影響

選取由株1S幼穗經(jīng)過21d誘導培養(yǎng)所得的新鮮愈傷組織，接種于繼代培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng).以25d為一個繼代培養(yǎng)周期，將愈傷組織分別繼代培養(yǎng)1～9個周期.然后將經(jīng)過不同時間繼代培養(yǎng)的愈傷組織轉移至分化培養(yǎng)基中進行分化培養(yǎng)，28d后統(tǒng)計愈傷組織的分化率.

1.2.4 2，4－D濃度對誘變頻率的影響

選取由株1S幼穗經(jīng)過3周誘導培養(yǎng)所得的新鮮愈傷組織，先于繼代培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)1個周期.然后將愈傷組織轉移至分別添加2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5和5.0mg／L 2，4－D的 MS基本培養(yǎng)基中，誘變處理1個周期（圖1（b））.經(jīng)誘變處理的愈傷組織再轉移至繼代培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)1個周期，以恢復其活力.最后選取活力較好的胚性愈傷組織進行分化和生根培養(yǎng)（圖1（c）和（d）），所得分化苗（R1）經(jīng)煉苗后移栽至大田中.抽穗期套袋使其自交結實，并單株收種（R2）.再將收集的種子按株系播種于大田中，按照劉選明等[13]方法于整個生長發(fā)育時期考察R2代株系的農(nóng)藝性狀.與對照（未經(jīng)誘變的植株）相比，只要某個肉眼可見的性狀發(fā)生顯著變異即被視為突變株系.誘變頻率計算公式為：誘變頻率＝變異株系數(shù)／總的再生株系數(shù)×100%.

1.2.5 不同外植體對誘變頻率的影響

分別選取株1S的幼穗、幼胚和成熟胚作為外植體誘導愈傷組織.先繼代1個周期，然后在4.0mg／L 2，4－D的 MS培養(yǎng)基上誘變1個周期.其后的步驟與2，4－D濃度對誘變頻率影響的實驗方法相同.最后分別統(tǒng)計3種外植體對誘變頻率的影響.

1.2.6 矮稈突變體的篩選和表型鑒定

具體方法參照我們先前發(fā)表的一篇論文[14]，主要于R2代考查其株高性狀，并觀察其性狀分離情況.對于比原親本水稻株高有所降低而且能穩(wěn)定遺傳的突變株系，于抽穗期套袋使其自交結實和采收種子（R3），同時考察和評價其農(nóng)藝性狀.對符合目標性狀且穩(wěn)定遺傳的變異株即為優(yōu)良誘變品種（系）.

1.2.7 莖的單位長度干物質含量分析

于成熟期分別隨機選擇株1S和SV14S各20株，先測量整個莖稈的長度，然后將各節(jié)間分開，分別測量各節(jié)間長度.將各節(jié)間再置于50°C烘箱烘烤16h，于分析天平稱取各節(jié)間重量.最后，根據(jù)所得的數(shù)據(jù)，計算整個莖稈和各節(jié)間重量（mg）／長度（cm）的比值.另外，統(tǒng)計突變株系SV14S的重量（mg）／長度（cm）比值的增加率.其計算公式為：增加率＝[SV14S的比值（mg／cm）－株1S的比值（mg／cm）]／株1S的比值（mg／cm）×100%.

2 結果與討論

2.1 繼代時間對植株再生的影響

已有研究發(fā)現(xiàn)[15]，組織培養(yǎng)的體細胞變異頻率隨培養(yǎng)時間的延長而提高.但是隨著培養(yǎng)時間的延長，其愈傷組織的分化頻率也急劇下降，往往導致再生苗分化的極度困難.因此，我們首先研究了繼代時間對植株再生的影響，以尋找愈傷組織的最佳繼代時間.以25d為一個培養(yǎng)周期，挑取剛從株1S幼穗誘導出來的顏色淡黃、質地致密的胚性愈傷組織于繼代培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)，分別繼代0～9個周期，然后轉接到分化培養(yǎng)基上觀察并統(tǒng)計分化頻率.其中，繼代0周期的胚性愈傷組織即為剛從幼穗誘導出來的胚性愈傷組織轉接到分化培養(yǎng)基.實驗結果發(fā)現(xiàn)，當繼代4個周期以上，其愈傷組織的分化頻率急劇下降，由繼代3個周期時的59.0%急降至15.8%左右（圖2（a））.因此，為了保持較高的分化頻率和變異頻率（由繼代時間決定），我們認為在高濃度2，4－D誘變處理前的最佳繼代時間為3個周期.

圖2 影響植株再生和誘變頻率因素的分析Fig.2 Effect of factors on the frequencies of plant regeneration and mutagenesis

2.2 2，4－D濃度對誘變頻率的影響

2，4－D作為一種人工合成的生長素類的植物激素被廣泛應用于各種植物組織培養(yǎng)中，主要用于愈傷組織的誘導[16－17].但是我們發(fā)現(xiàn)，當經(jīng)高濃度2，4－D處理后的愈傷組織其突變率顯著增加（圖2（b））.同時也發(fā)現(xiàn)，隨著2，4－D濃度的升高（＞3.0 mg／L）以及處理時間的延長，愈傷組織的活力也顯著降低，容易褐化死亡，嚴重影響了后續(xù)的分化頻率.因此，綜合考慮分化和變異頻率，應以變異頻率較高而分化頻率不能太低，即分化頻率下降曲線與變異頻率上升曲線交叉點的2，4－D濃度為最佳誘變濃度.從圖2（b）可看出，2，4－D的最佳誘變濃度為4.0mg／L.值得特別指出的是，愈傷組織在4.0 mg／L 2，4－D的繼代培養(yǎng)基中的誘變時間不能超過1個周期（約25d），否則后續(xù)的分化頻率很低，而且大多數(shù)愈傷組織會褐化壞死（結果未列出）.

2.3 不同外植體對誘變頻率的影響

在水稻組織培養(yǎng)中，一般選用幼穗、幼胚和成熟胚作為外植體[13，16－17].在3種外植體中，究竟哪種最適合作為體細胞無性系變異的外植體呢？迄今還未見相關研究內容的文獻報道.于是我們研究了水稻幼穗、幼胚和成熟胚等3種外植體對誘變頻率的影響.研究結果發(fā)現(xiàn)，由幼穗誘導的愈傷組織的誘變頻率達到了24.7%，由幼胚誘導的為5.2%，而由成熟胚誘導的僅為3.8% （圖2（c））.在單一性狀的變異方面，由幼穗誘導的愈傷組織的誘變頻率也很高.如由株1S幼穗誘導、誘變和再分化得到的500株分化苗中，經(jīng)在海南陵水基地的表型鑒定，發(fā)現(xiàn)共有24株表現(xiàn)出株高不同程度的矮化.就株高性狀的變化來說，其突變率達到了4.8% （24／500）（表2）.而由成熟胚誘導的愈傷組織經(jīng)誘變和再分化后得到的分化苗中，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)矮化突變株（結果未列出）.由此可以看出，在體細胞無性系誘變的外植體中，幼穗明顯優(yōu)于幼胚和成熟胚.其可能的原因是處于花粉母細胞形成時期的水稻細胞在離體培養(yǎng)條件下對外界環(huán)境更敏感，更易發(fā)生變異.另外，幼穗作為外植體還有具有愈傷組織誘導率高和活力強等優(yōu)勢（結果未列出）.因此，體細胞無性系誘變育種的最佳外植體為幼穗.

表2 不同基因型水稻的R2代體細胞無性系中的單一性狀的突變頻率Tab.2 Frequencies of one trait mutations in R2lines of somaclones of different genotypes of Oryza sativa L.

2.4 不同品種的體細胞突變頻率的分析

通過上面以株1S為材料進行的繼代時間、2，4－D濃度和不同外植體對誘變和分化頻率的影響，初步建立了以幼穗為外植體，以4.0mg／L 2，4－D為最佳誘變濃度的體細胞無性系誘變方法.為了進一步驗證該方法的有效性，我們對包括株1S在內的水稻品種中9B，R527和316B等進行了無性系誘變.為了實驗的準確性，僅以單一性狀的突變進行統(tǒng)計分析.在生產(chǎn)中，株1S，中9B和R527的株高偏高，導致所配組合抗倒伏性差，而316B的種子穎殼閉合度差，容易導致種子霉變和發(fā)芽率降低.因此，在株1S，中9B和R527中，以矮稈或半矮稈突變株系進行統(tǒng)計分析，而316B則以種子穎殼閉合度好的突變株系進行統(tǒng)計分析.實驗結果發(fā)現(xiàn)，誘變頻率最高的是株1S，在500株分化苗中共得到了24個矮化變異株系，其誘變頻率達到了4.8% （24／500）.誘變效率最低的是316B，在236株分化苗中僅得到了1個種子穎殼閉合度較好的突變株系，其誘變頻率僅為0.42% （1／236）.中9B和R527分別為2.33%和1.42% （表2）.由此說明，體細胞無性系的突變率還取決于品種間的基因型差異.

2.5 矮稈突變株系的表型分析

在株1S的24個SV矮化突變株系中，選取了SV5S，SV10S和SV14S等3個綜合農(nóng)藝性狀較優(yōu)的變異株系，對它們的株高和各節(jié)間長度進行了分析.由于在不育狀態(tài)時不育系水稻的穗不能完全從旗葉的葉鞘中伸展出來，對植株高度的測量產(chǎn)生很大的影響[18－19].因此，親本株1S和其SV突變體（R3）都是經(jīng)20℃低溫處理使其育性恢復后于成熟期測量株高及節(jié)間長度（表3）.從表中的統(tǒng)計結果可知，在株高上出現(xiàn)株1S，SV10S，SV14S和SV5S依次變矮的順序，其節(jié)間特別是基部的節(jié)間明顯縮短，而穗長卻縮短幅度很小.該結果說明，矮化突變體能顯著提高抗倒伏性.通過進一步綜合農(nóng)藝性狀的鑒定和評價，發(fā)現(xiàn)SV14S的各種農(nóng)藝性狀更加優(yōu)良[13].于是我們檢測了株1S和SV14S各節(jié)間及整個莖稈的單位長度干物質含量，以進一步研究SV14S的抗倒伏能力.實驗結果發(fā)現(xiàn)，除了第一節(jié)間外，SV14S其它節(jié)間的單位長度干物質含量均比親本株1S高（表4）.該結果說明，突變體SV14S既能增加抗倒伏性，又能提高產(chǎn)量.雜交配組實驗也進一步說明了SV14S的優(yōu)良抗倒伏性能.如SV14S與恢復系912的雜種后代（F1）的抗倒伏性明顯優(yōu)于株1S與912的雜種后代（結果未列出）.因此，突變株系SV14S在雜交水稻育種中具有良好的應用前景.另外，我們還對突變株系SV14S進行了相關分子生物學分析，并在基因水平上證明該突變體確實發(fā)生了穩(wěn)定變異，具體結果見先前發(fā)表的相關文章[14，20－21].

在中9B的5個SV矮化突變株系中，經(jīng)過3～4代的考察和評價，選取了其中綜合農(nóng)藝性狀最優(yōu)的矮化株系命名為SV9B，并對其農(nóng)藝性狀進行了考察和評價.圖3顯示了SV9B和對照親本中9B的植株形態(tài)、株高和各節(jié)間長度.從圖可知，中9B和SV9B的植株高度分別為93cm和75cm，SV9B的株高明顯低于對照親本中9B（圖3（a）和（b）），而且SV9B的各節(jié)間均縮短，其中基部節(jié)間長度縮短明顯，而上部節(jié)間長度縮短幅度較?。▓D3（c）和（d））.特別是SV9B的III節(jié)間的縮短幅度最大，還不到中9B的III節(jié)間長度的一半.另外，我們還測量了中9B和SV9B成熟穗的農(nóng)藝性狀（圖4和表5），發(fā)現(xiàn)與對照親本中9B相比，SV9B的穗長幾乎沒有變化，初級小穗數(shù)和千粒重稍微降低，而次級小穗數(shù)和每穗粒數(shù)卻顯著增加.同時，SV9B的種子比中9B的種子更加飽滿（圖4（c））.這些結果說明，突變體SV9B不僅增加了抗倒伏性，而且提高了單株產(chǎn)量，具有良好的應用前景.

圖3 SV9B和親本中9B的表型Fig.3 Phenotypes of SV9Band its parent Zhong 9B

圖4 SV9B和親本中9B穗的性狀Fig.4 Panicle traits of SV9Band its parent Zhong 9B

表3 株1S的體細胞突變株系的植株及節(jié)間高度Tab.3 Plant height of somatic variant lines derived from Zhu1Sin R3generation

表4 SV14S和親本株1S各節(jié)間及整個莖稈的單位長度干物質含量Tab.4 The dry matter content per unit length of each internode and overall culm of SV14Sand its parent Zhu1S

表5 SV9B和親本中9B的穗的性狀比較Tab.5 Comparison of panicles of SV9Band its parent Zhong 9B

優(yōu)良矮稈突變株系SV14S和SV9B的成功選育為后續(xù)的傳統(tǒng)雜交育種提供了優(yōu)質種質資源.隨后，以SV14S與優(yōu)質抗稻瘟病父本ZR02雜交，通過“人工低溫與自然低溫雙重壓力選擇”和定向培育，育成優(yōu)質兩用核不育系湘陵628S（品種授權號：CNA20070803.1）.用該親本選配的雜交組合在國家和湖南省區(qū)試評比中農(nóng)藝性狀表現(xiàn)優(yōu)異（結果未列出），已獲準大面積商業(yè)推廣.如超級雜交早稻組合陵兩優(yōu)268，兩年國家區(qū)試第一名，已通過國家審定.同樣，利用SV9B與三系胞質不育系T98A測交、多代回交選育出抗倒伏的優(yōu)質三系胞質不育系SV9－16A，利用該親本選育的優(yōu)質超級雜交稻組合即將應用于生產(chǎn).總之，這些卓有成效的育種成果的取得進一步證實，利用幼穗為外植體和2，4－D為誘變劑的水稻體細胞誘變育種方法是一種簡單有效的新型育種方法.同時也說明，在整個誘變和后續(xù)的選育過程中，如果結合一定的選擇壓力可以有效加快育種進程.

3 結 論

在本研究中，通過研究繼代時間、2，4－D濃度和不同外植體對誘變和分化頻率的影響，初步建立了以幼穗為外植體、誘變前繼代培養(yǎng)時間為3個周期（約75d）以及以4.0mg／L 2，4－D為最佳誘變濃度的體細胞誘變育種方法.同時，利用該方法誘變株1S和中9B，分別成功選育到了優(yōu)良矮化突變株系SV14S和SV9B，為后續(xù)的傳統(tǒng)雜交育種提供了優(yōu)質種質資源.這些育種成果的取得進一步證實了該水稻體細胞誘變育種方法是一種簡單有效的新型育種方法.

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