化學(xué)修飾改進脂肪酶催化特性的研究及食品中應(yīng)用

武玉婷，李 春，* ，王晨旭，劉 寧，3，邵美麗，*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030;2.國家移動實驗室研究發(fā)展與評價中心，黑龍江哈爾濱150036;3.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開發(fā)中心，黑龍江哈爾濱150028)

通過利用化學(xué)手段將大分子或某些功能基團結(jié)合到酶分子上，改變酶的理化性質(zhì)，最終達到改變酶的催化性質(zhì)的目的，被稱為酶的化學(xué)修飾［1］?；瘜W(xué)修飾可以在不知道酶蛋白結(jié)構(gòu)的情況下，允許大范圍的化學(xué)基團快速引入到酶的結(jié)構(gòu)中，使酶蛋白折疊構(gòu)象發(fā)生改變，繼而改變酶結(jié)構(gòu)及其催化性能。目前的化學(xué)修飾的研究基本上都是針對酶側(cè)鏈的修飾，主要包括酶分子表面的非選擇性修飾和分子內(nèi)部特異位點的選擇性修飾［2］。通過選擇合適的化學(xué)修飾劑及修飾方法，就可以快速、廉價地提高酶的活性和穩(wěn)定性，甚至合成出新的酶。脂肪酶(又名三酰甘油酯水解酶，EC3.1.1.3)是一類能在油水界面或水不溶性系統(tǒng)中催化水解、酸解、醇解、胺解、酯化、轉(zhuǎn)酯、酯交換等多種化學(xué)反應(yīng)的生物催化劑，具有化學(xué)選擇性、立體選擇性、位點選擇性和底物專一性等特點［3］。目前，我們對脂肪酶的結(jié)構(gòu)和性能已有了大量的研究，表明不同來源的脂肪酶雖然氨基酸組成不同，但是其催化中心具有相同或相似的區(qū)域，大多數(shù)的脂肪酶的活性中心由絲氨酸(Ser)和組氨酸(His)參與組成，Ser、His與另一種氨基酸殘基一起構(gòu)成脂肪酶催化活性中心的三元組［4］。將脂肪酶的理論研究與實際應(yīng)用聯(lián)系到一起對于生產(chǎn)具有很重要的作用。通過化學(xué)修飾的方法來改變脂肪酶的性能，對促進其工業(yè)化發(fā)展具有很大的幫助。由于化學(xué)修飾高效簡便的特性，使它在酶修飾的研究中被廣泛應(yīng)用。本文就以脂肪酶為例，主要綜述通過化學(xué)修飾來改變脂肪酶催化特性的研究進展及應(yīng)用動態(tài)。

1 脂肪酶的化學(xué)修飾

1.1 關(guān)鍵基團的化學(xué)修飾

在酶活性中心上的關(guān)鍵基團的特定化學(xué)修飾是分析酶中關(guān)鍵基團的常見技術(shù)，化學(xué)修飾的酶可能會改變酶活性中心中的關(guān)鍵基團，這將使酶的活性顯著下降，甚至導(dǎo)致酶失活［5］。將具有氨基酸特異性的修飾劑鏈接到酶分子中，通過酶活性的變化，以判斷酶活性中心部位氨基酸的種類。2009年于忠良［6］等通過這樣的方法，采用NBS(N－溴代琥珀酰亞胺)、EDC(1－乙基－(3－二甲基氨基丙基)碳二亞胺)、DEPC(二乙基焦炭酸鹽)、CH－T(氯胺－T)、PMSF(苯甲基磺酰氟)、DTNB(5，5＇－二硫代雙(2－硝基苯甲酸))等6種特異性化學(xué)修飾劑對根霉ZM－10脂肪酶進行化學(xué)修飾，研究其分子中氨基酸側(cè)鏈基團與酶活性中心的關(guān)系。初步探明脂肪酶分子中表現(xiàn)酶活性所必需的氨基酸的種類、酶活性中心部位氨基酸種類，揭示脂肪酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，為今后根霉ZM－10脂肪酶研究提供理論和方法基礎(chǔ)。宋欣等［7］在對絲孢酵母脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)研究的過程中，采用相似的方法，利用不同的化學(xué)修飾劑對酶蛋白進行修飾，通過酶催化活力的改變，來分析判斷酶活性中心的氨基酸殘基。

但是通過化學(xué)修飾的方法只可以判斷酶的部分關(guān)鍵基團，且具有一定的局限性。只有當(dāng)修飾劑與酶關(guān)鍵基團具有特異性關(guān)系時，才能確定對應(yīng)基團，但是無法判斷對應(yīng)基團的數(shù)量。而且通過失活來判斷與酶活性中心的關(guān)系，這樣的方法精確度較低，忽略了修飾劑對酶構(gòu)象產(chǎn)生影響而使酶失活的現(xiàn)象。所以挑選具有較強專一性的修飾劑并且借助其他方法才能對酶活性中心氨基酸做出精確判斷。

1.2 小分子的化學(xué)修飾

酶的化學(xué)修飾，可能會通過大量的酶表面殘基修飾而改變酶的性能。酶表面的羧基、酚基和巰基等官能團，通過化學(xué)修飾鏈接一些小分子修飾劑發(fā)生烷基化、糖基化和酰胺化等反應(yīng)，從而改變酶的性能。目前已被廣泛研究應(yīng)用的小分子化合物有氨基葡萄糖、乙酸酐、硬脂酸、鄰苯二酸酐等。早在1989年 Kaimal［8］等利用丁醛、異丁醛、丙酮通過還原羥基化反應(yīng)提高豬胰脂肪酶的活性，現(xiàn)今李康［9］等采用琥珀酸酐、丙酸酐、乙酸酐來修飾Novozym 435脂肪酶，對修飾后脂肪酶的催化性能進行測定，結(jié)果顯示酸酐對脂肪酶的活性、穩(wěn)定性和耐有機溶劑的能力等有很大的提高。熊亞紅［10］等利用鄰苯二甲酸酐修飾豬胰脂肪酶，對修飾后酶的最適反應(yīng)條件和酸堿熱穩(wěn)定性進行考察，結(jié)果反應(yīng)條件和溫度未見較大變化，但是熱穩(wěn)定性有顯著提高，可見鄰苯二甲酸酐的化學(xué)修飾是一種改善脂肪酶穩(wěn)定性的有效方法。另一種常用的化學(xué)修飾劑就是乙二胺，胺化的羧基基團可以與乙二胺結(jié)合，在中性pH下將帶正負電荷的基團相交換而改變脂肪酶的對應(yīng)選擇性和活性［11］。用活化后的乙二胺修飾已固定的米曲霉脂肪酶，修飾酶在變性電泳中的遷移率較未改性的脂肪酶有顯著的變化，主要是由于電荷變化引起，并且需要較高濃度的陽離子去污劑，才能從固定載體上解吸下來，使得脂肪酶的穩(wěn)定性在pH為5時有了顯著提高［12］。

1.3 化學(xué)交聯(lián)

通過化學(xué)修飾酶表面的幾種不同基團間建立化學(xué)交聯(lián)，而達到提高酶活性的目的。蛋白質(zhì)的化學(xué)交聯(lián)可以有多種情況，即可以是分子內(nèi)部交聯(lián)也可以是分子間或涉及到不同分子的交聯(lián)［13］。在利用雙或多功能基試劑作為修飾劑時，是酶蛋白發(fā)生分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)。不同分子間的交聯(lián)在酶固定化中應(yīng)用較為廣泛。通過酶的固定化技術(shù)，使酶與固定載體之間相互交聯(lián)(通常使用戊二醛)，其中載體對酶起到支撐作用，防止了酶的脫落。有時，固定化方法的不同對酶修飾后功能也產(chǎn)生一定影響影響，Barbosa［14］等利用乙二胺和三硝基苯磺酸修飾已固定的南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)，結(jié)果通過共價固定的酶的活性下降了60%左右，而通過吸附固定的酶的活性增加了兩倍。

1.4 聚合物的化學(xué)修飾

利用聚合物來修飾酶可以有很多的好處［15］。首先，聚合物分子可能比酶蛋白的分子還要大，結(jié)合到酶表面，可以以一種更緩和并且容易的方法來改變酶表面的性能。其次，聚合物包含了很多的活性基團，這些基團中有些性能甚至是天然酶分子所沒有的。這些特征的結(jié)合使這類多功能聚合物適合于在蛋白表面提供多點式的化學(xué)交聯(lián)。聚合物將會覆蓋酶表面的大部分，并且會與覆蓋處的基團發(fā)生反應(yīng)，該反應(yīng)沒有距離的限制，也沒有與一個點反應(yīng)而產(chǎn)生的競爭。然而聚合物修飾的缺點就是柔韌結(jié)構(gòu)的聚合物和鍵與鍵之間產(chǎn)生的環(huán)將會限制酶的硬化。

在高分子量聚合物修飾劑中，分子質(zhì)量在500～20000范圍內(nèi)的聚乙二醇類修飾劑應(yīng)用最廣，且大分子的單甲氧基聚乙二醇(mPEG)更利于降低修飾酶的抗原性，它是既能溶于水，也可以溶于大多數(shù)有機溶劑的兩性分子［16］。例如，在 Ruiza［17］等對 CALB 的研究中，固定化的CALB用琥珀酸聚乙二醇進行修飾，用琥珀酸胺化的酶，可以與約14～15個PEG分子結(jié)合，使酶的性能發(fā)生改變;Godoy［18］等在已知嗜熱芽孢桿菌脂肪酶(BTL2)結(jié)構(gòu)的情況下，對BTL2一個單獨的外部半胱氨酸殘基進行定點修飾，利用活化后的葡聚糖和聚乙二醇與Cys－64的硫醇基發(fā)生二硫化物交換進行修飾，來穩(wěn)定BTL2的活性狀態(tài)，修飾酶的活性主要依賴于固定化的準備以及聚合物和底物。

多糖由于無毒溶于水并且具有生物相容性等優(yōu)點，被多次應(yīng)用于酶的化學(xué)共價修飾來提高穩(wěn)定性和降低免疫原性。Siddiqui［19］等用高分子量的葡聚糖、聚蔗糖和低分子量的菊粉對CALB進行修飾，研究表明，用硼氫化鈉或巰基硼氫化鈉鏈接各種聚合糖到酶表面，對酶的穩(wěn)定性都有顯著的提高，用高分子量的葡聚糖不僅穩(wěn)定性增強，活性的增加也極為明顯。

通過化學(xué)修飾而得到的高活性的脂肪酶在利用的過程中，如能將其回收并重復(fù)使用，在其工業(yè)應(yīng)用中會帶來巨大的經(jīng)濟效益，必將成為未來酶發(fā)展的熱點。王建龍［20］等利用磁性殼聚糖為載體固定脂肪酶，使酶的分離回收較方便。Yoshimoto［21］等利用戊二醛將聚乙二醇修飾的脂肪酶與Fe2+連接，形成有磁性的共聚物，并且得到的磁性酶在磁場中回收的過程中并沒有損傷到酶的活性。酶的高價格必將導(dǎo)致其應(yīng)用成本的提高，所以酶的回收利用勢在必行，修飾酶的磁性化將會是未來研究的重點。

2 修飾脂肪酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用

通過化學(xué)修飾來改變脂肪酶的性能，為適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)提供了良好的基礎(chǔ)。修飾后的脂肪酶活性的增加，提高了脂肪酶在催化過程中目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率;穩(wěn)定性的增強，拓寬了脂肪酶的應(yīng)用條件;選擇性的變化，改變了脂肪酶專一性作用的底物。目前，利用脂肪酶在油脂酯交換合成母乳脂肪替代物和生產(chǎn)類可可脂以及油脂水解方面都有廣泛的應(yīng)用。

2.1 修飾酶在乳品工業(yè)應(yīng)用

很多微生物都可以產(chǎn)生脂肪酶，并對乳制品的品質(zhì)產(chǎn)生影響，如會水解乳中脂肪酸產(chǎn)生酸敗味，當(dāng)奶油被霉菌污染后，其產(chǎn)生的脂肪酶會使奶油酸敗變苦;脂肪酶也會使干酪制品產(chǎn)生不良風(fēng)味;在酸乳制品中也會酶解游離脂肪酸抑制發(fā)酵劑的生長［22］。雖然脂肪酶在乳制品中會這些不利影響，但是利用其對油脂Sn－1，3位特異性，催化油脂和游離脂肪酸酯交換反應(yīng)合成母乳脂肪類似物，添加到嬰幼兒奶粉中具有重大的意義。

Yüksel［23］等用三棕櫚酸甘油酯與榛子油等游離脂肪酸在經(jīng)固定化的Lipozyme TL IM催化下生產(chǎn)含有十八碳四烯酸的人體乳脂肪類似物。采用響應(yīng)面方法對反應(yīng)溫度、時間和底物摩爾比這三個因素對合成人體乳脂肪類似物的影響。這種脂肪類似物可以應(yīng)用于嬰兒配方奶粉中，其中含有的多不飽和脂肪酸對人體健康有著重要的作用。

Esteban［24］等用 Sn－2 位富含棕櫚酸的甘油三酯和游離的油酸來合成結(jié)構(gòu)油脂OPO(1，3－二油酸－2－棕櫚酸三酰甘油列為新型營養(yǎng)強化劑用于嬰兒配方食品、較大嬰兒和幼兒配方食品，并規(guī)定其含量不少于40%)。通過篩選不同來源的微生物脂肪酶，在無溶劑的條件下酸解反應(yīng)合成OPO。且以棕櫚硬脂酸為原料合成的結(jié)構(gòu)油脂中Sn－2位棕櫚酸含量為66%并Sn－1，3位油酸含量為67.5%，比人乳含量的44.8%要高很多。

2.2 修飾酶在油脂加工中的應(yīng)用

脂肪酶可以催化油脂水解反應(yīng)，這在肥皂制造工業(yè)上廣泛應(yīng)用。也可以催化酯與酸或醇發(fā)生酯交換反應(yīng)，改變油脂的性質(zhì)。Rodrigues［25］等結(jié)合兩種不同的脂肪酶共同作用，酶法水解大豆油。Ferna’ndez－Lorente［26］等利用通過物理或化學(xué)修飾的脂肪酶來釋放魚油中的不飽和脂肪酸。Liu［27］等利用脂肪酶催化豬油和三硬脂酸甘油酯發(fā)生酯交換反應(yīng)在二氧化碳超臨界狀態(tài)下合成可可脂。

3 結(jié)語

眾多科研工作者利用化學(xué)修飾的方法改善脂肪酶催化活性，已成為前沿研究的熱點。脂肪酶作為催化合成結(jié)構(gòu)油脂的重要催化劑，許多酶的結(jié)構(gòu)和作用機理逐漸被揭示，在理論和工業(yè)應(yīng)用上都有重要的意義。利用化學(xué)修飾的方法快速有效的提高脂肪酶的活性、穩(wěn)定性以及專一性，甚至合成新的酶，成為未來發(fā)展的重點。所以通過化學(xué)修飾來產(chǎn)生更適于工業(yè)化生產(chǎn)的生物催化劑具有誘人的發(fā)展前景。

然而化學(xué)修飾也有一定的局限性，在未知酶結(jié)構(gòu)的情況下，酶與修飾劑的特異性結(jié)合是相對的，如多位點結(jié)合將產(chǎn)生非均一的混合物，對修飾酶的分析會產(chǎn)生一定影響。所以更加深入的了解酶結(jié)構(gòu)對挑選適合修飾劑及提高酶的性能有著重要的意義。

［1］黎春怡，黃卓烈.化學(xué)修飾法在酶分子改造中的應(yīng)用［J］.生物技術(shù)通報，2011，9:39－43.

［2］Davis B.Chemical modification of biocatalysts［J］.Current Option in Biotechnology，2003，14:379－386.

［3］Davis BG，Boyer V.Biocatalysis and enzymes in organic synthesis［J］.Natural Product Reports，2001，18(6):618－64.

［4］郭諍，張根旺.脂肪酶的結(jié)構(gòu)特征和化學(xué)修飾［J］.中國油脂，2003，28(7):5－10.

［5］Rodrigues RC，Berenguer－Murcia A，F(xiàn)ernandez－Lafuentec R.Coupling Chemical Modification and Immobilization to Improve the Catalytic Performance of Enzymes［J］.Advanced Synthesis Catalysis，2011，353，2216－2238.

［6］于忠良，陳義倫，李娜.根霉ZM－10脂肪酶的分離純化和活性部位的化學(xué)修飾［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36(2):39－42.

［7］宋欣.絲孢酵母脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)和化學(xué)修飾［J］.微生物學(xué)通報，2007，34(4):723－726.

［8］Kaimal TNB，Saroja M.Enhancement of catalytic activity of porcine pancreatic Lipase by Reductive Alkylation［J］.Biotechnology Letters，1989，11(1):31－36.

［9］李康，尹春華.酸酐修飾脂肪酶的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(31):19043－19045

［10］熊亞紅，蘇健鴻，劉小平.鄰苯二甲酸酐修飾脂肪酶的性能研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，32(2):121－124.

［11］Palomo JM，F(xiàn)ernandez－Lorente G，Guisan JM，et al.Modulation of immobilized Lipase Enantioselectivity via chemical amination［J］.Advanced Synthesis Catalysis，2007，349，1119－1127.

［12］Galvisa M，Barbosaa O，Torresa R.Effect of solid－phase chemical modification on the features ofthe lipase from Thermomyces lanuginosus［J］.Process Biochemistry，2012，47:460－466.

［13］Wong SS，Wong LJC.Chemical crosslinking and the stabilization of proteins and enzymes［J］.Enzyme and Microbial Technology，1992，14:866－874.

［14］Barbosa O，Ruiz O，Ortiz C，et al.Modulation of the properties of immobilized CALB by chemical modification with 2，3，4－ trinitrobenzenesulfonate or ethylendiamine.Advantages of using adsorbed lipases on hydrophobic supports［J］.Process Biochemistry，2012，47:867－876.

［15］Rodrigues RC，Berenguer－Murcia A，F(xiàn)ernandez－Lafuente R.Coupling chemical modification and immobilization to improve the catalytic performance of enzymes［J］.Advanced Synthesis Catalysis，2011，353，2216－2238.

［16］馬曉建，吳勇.化學(xué)修飾酶的研究進展［J］.化學(xué)與生物工程，2004，6:7－9.

［17］Ruiza M，Galvisa M.Solid－phase modification with succinic polyethyleneglycol of aminated lipase B from Candida antarctica:Effectofthe immobilization protocolon enzyme catalytic properties［J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2013，87:75－82.

［18］Godoy CA，Rivas B.Enhanced activity of an immobilized lipase promoted by site－directed chemical modification with polymers［J］.Process Biochemistry，2010，45:534－541.

［19］Siddiqui KS，Cavicchioli R.Improved thermal stability and activity in the cold－adapted lipase B from Candida antarctica following chemical modification with oxidized polysaccharides［J］.Extremophiles，2005，9:471－476.

［20］王建龍，謝文磊，張軍輝，等.磁性殼聚糖微球固定化脂肪酶研究［J］.糧食與油脂，2010，12:16－19.

［21］ Takayuki Yoshimoto， Takeshi Mihama， Katsunobu Takahashi，et al.Chemical modification of enzymes with activated magnetic modifier［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，1987，145(2):908－914.

［22］劉晶，韓清波.乳脂酶及其對乳制品品質(zhì)的影響［J］.食品工業(yè)科技，2006，27(4):194－196.

［23］Yüksel A，Yesil?ubuk NS.Enzymatic production of human milk fat analogues containing stearidonic acid and optimization of reactions by response surface methodology［J］.Food Science and Technology，2012，46:210－216.

［24］ Esteban L，Jiménez MJ.Production of structured triacylglycerols rich in palmitic acid at sn－2 position and oleic acid at sn－1，3 positions as human milk fat substitutes by enzymatic acidolysis［J］.Biochemical Engineering Journal，2011，54:62－69.

［25］Rodrigues RC，Ayub MAZ.Effects of the combined use of Thermomyces lanuginosus and Rhizomucor miehei lipases for the transesterification and hydrolysis of soybean oil［J］.Process Biochemistry，2011，46:682－688.

［26］Ferna’ndez－Lorente G，Betancor L，Carrascosa AV，et al.Modulation of the selectivity of immobilized lipases by chemical and physical modifications:release of omega－3 fatty acids from fish oil［J］.Journal of the American Oil Chemists’Society，2012，89:97－102.

［27］Liu KJ，Chang HM，Liu KM.Enzymatic synthesis of cocoa butter analog through interesterification of lard and tristearin in supercritical carbon dioxide by lipase［J］.Food Chemistry，2007，100:1303－1311.