肝纖維化的動(dòng)物模型制備研究

王曉麗

(臨汾職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 臨汾 041000)

肝纖維化是許多無(wú)關(guān)損傷病因的慢性肝病的一個(gè)典型的結(jié)果。它來(lái)自生理傷口愈合反應(yīng)的連續(xù)輪回或長(zhǎng)期激活，從而維持了持久性纖維形成，最終導(dǎo)致器官的漸進(jìn)纖維化［1］。為研究肝纖維化，評(píng)估治療方法和策略的抗肝纖維化效果，幾十年來(lái)動(dòng)物模型一直都在被使用［2］。該領(lǐng)域(纖維化動(dòng)力學(xué)，基質(zhì)生成細(xì)胞、主要機(jī)制和纖維化相關(guān)胞內(nèi)信號(hào)通路的識(shí)別，基質(zhì)重塑和纖維化可逆性的概念和機(jī)制……)的重大進(jìn)展都來(lái)自動(dòng)物模型的研究，來(lái)自實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床資料的對(duì)比。

1 肝纖維化的體內(nèi)研究模型

動(dòng)物模型可進(jìn)行的研究包括:a)在人類研究中不能被解決的問(wèn)題而需要復(fù)雜而全面的研究;b)在疾病演化與回歸的關(guān)鍵時(shí)刻進(jìn)行多次采樣;c)實(shí)驗(yàn)測(cè)試的變量數(shù)可以保證科學(xué)試驗(yàn)要求的最低限度。與體外模型相反，整個(gè)器官是完整的(不同類型的細(xì)胞和基質(zhì)之間的相互作用)，也是一個(gè)活體的一部分，神經(jīng)、內(nèi)分泌、神經(jīng)內(nèi)分泌、循環(huán)系統(tǒng)、飲食、腸源性等等，這些因素的影響也能得到兼顧［2］。

動(dòng)物模型的缺點(diǎn)是在動(dòng)物身上復(fù)制人類疾病，他們?cè)诿庖叻磻?yīng)、基因表達(dá)/調(diào)控、代謝、藥理或組織反應(yīng)等方面與人體有大的種屬差異［3］。在動(dòng)物模型中的纖維化誘導(dǎo)刺激的選擇根據(jù)的是研究者的想法，期望與動(dòng)物反應(yīng)相聯(lián)系起來(lái)的發(fā)病機(jī)制能夠類似于那些發(fā)生在人類相關(guān)疾病的機(jī)制。這種想法在某種情況下可能是自欺欺人、一廂情愿的。為人類疾病提供一個(gè)完美的模擬、涉及相同的致病因素和病理生物學(xué)過(guò)程(包括免疫/炎癥反應(yīng))，病理和疾病重現(xiàn)性達(dá)到與人體相同的結(jié)果，這對(duì)于任何動(dòng)物模型而言，幾乎不可能。因此，把在動(dòng)物模型觀察到的結(jié)果應(yīng)用到臨床上時(shí)必須格外小心。

雖然動(dòng)物模型對(duì)理解病理生理過(guò)程具有巨大的價(jià)值，但他們是模型的本質(zhì)沒(méi)有發(fā)生改變，他們不能重復(fù)再現(xiàn)真正的人類疾病。所以說(shuō)，每一個(gè)模型(包含目標(biāo)、設(shè)計(jì)、株系和物種)顯示纖維化的發(fā)病機(jī)制、局部解剖和演化都有自己獨(dú)特的特點(diǎn)。在使用一個(gè)動(dòng)物模型之前，首先必須考慮的一般概念，如可重復(fù)性(一個(gè)通用時(shí)間框架內(nèi)，動(dòng)物部分達(dá)到預(yù)期的狀態(tài))，特異性(即模型應(yīng)該具有所需的異常，沒(méi)有任何其他的并發(fā)癥，如果這樣的并發(fā)癥確實(shí)存在，它必須具有典型性和可重復(fù)性)和可行性(實(shí)驗(yàn)室是否具備相應(yīng)的專業(yè)知識(shí)、人力、設(shè)備、經(jīng)特定訓(xùn)練的從事模型構(gòu)建或處理的人員)。纖維化發(fā)生被激活，但纖維化的特異性觸發(fā)與調(diào)控機(jī)制是取決于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所需的模型、設(shè)計(jì)、物種和品系，而事實(shí)上的確如此，不同的動(dòng)物模型，其纖維化的模式大不相同。

纖維化模型首先在大鼠被開(kāi)發(fā)，后來(lái)因?yàn)樾∈筮z傳學(xué)的優(yōu)勢(shì)而采用小鼠。在實(shí)驗(yàn)中當(dāng)大小是一個(gè)問(wèn)題時(shí)，例如實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行成像技術(shù)或血流動(dòng)力學(xué)測(cè)量時(shí)，大鼠可能會(huì)占有一定的優(yōu)點(diǎn)。在一些研究中，狒狒和黑猩猩已被分別用來(lái)研究酒精誘導(dǎo)和病毒性肝炎。

在測(cè)試一個(gè)潛在的抗纖維化劑的功效研究中，一般認(rèn)為藥物應(yīng)在至少兩個(gè)動(dòng)物模型中進(jìn)行［4］。關(guān)于使用這些模型的一個(gè)至關(guān)重要的問(wèn)題是，它們的使用應(yīng)注意匹配潛在抗纖維化劑的作用模式。在選擇可用的治療模型時(shí)，應(yīng)該首先考慮人群中肝損傷的起始病因。當(dāng)肝損傷的起始病因不能被處理和/或纖維化進(jìn)展為肝硬化時(shí)，使用動(dòng)物模型必須確?？估w維化劑不影響用來(lái)產(chǎn)生肝臟損傷的實(shí)驗(yàn)劑的肝毒性，也就是說(shuō)，如果使用四氯化碳肝纖維化模型，該抗纖維化劑不能是一個(gè)CYP2E 的抑制劑［5］。否則纖維化的減少可與肝臟損害的水平降低有關(guān)，而不是由于抗纖維化劑的作用。

在肝纖維化的基本機(jī)制和測(cè)試新的抗肝纖維化藥物研究中，以前開(kāi)發(fā)的各種動(dòng)物模型已經(jīng)發(fā)揮了重要功能［6］，但必須認(rèn)識(shí)到，與人的“對(duì)應(yīng)體”相比，它們都表現(xiàn)出一定的顯著的形態(tài)差異。至少膽汁淤積模型是這樣，特別是常見(jiàn)的膽管結(jié)扎，其纖維化的圖式與人的膽汁流動(dòng)中斷的癥狀是非常相似的。另一方面，常用的四氯化碳模型可能是研究纖維化和肝硬化回歸的最常用工具，但與大多數(shù)人類肝硬化相比，癥狀中的纖維隔卻很少能在動(dòng)物中觀察到，即使在長(zhǎng)期的四氯化碳誘導(dǎo)下，也是如此。人類和動(dòng)物模型疾病之間最重要的區(qū)別之一可能是后者缺乏血管相關(guān)的顯著改變，人類的肝硬化往往是通過(guò)二次缺氧事件摻入了肝細(xì)胞的損失，導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)的消失。這個(gè)現(xiàn)象不會(huì)發(fā)生在常用的動(dòng)物模型中。

2 肝纖維化的體外模型研究

至目前為止，雖然抗肝纖維化藥物研究的發(fā)展主要依靠體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，但是體外模型在研究肝纖維化發(fā)展中所涉及的機(jī)制方面則更具有優(yōu)勢(shì)［3］。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型一個(gè)重要的缺陷在于這些模型在很大程度上僅限于嚙齒類動(dòng)物，由于種間差異，這些模型提供的人類疾病和藥物毒性導(dǎo)致纖維化的預(yù)測(cè)值可能是有限的。另外，從動(dòng)物倫理角度出發(fā)，纖維化的體內(nèi)模型給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成很大的傷害，因此，應(yīng)盡可能地避免使用動(dòng)物。體外模型的主要優(yōu)點(diǎn)在于它是使用人體細(xì)胞或組織，可以解決物種的差異，其結(jié)果與人的疾病機(jī)理能有更高的相關(guān)性。

肝臟中纖維化的發(fā)展是一個(gè)多細(xì)胞過(guò)程，意味著不同的細(xì)胞類型涉及這個(gè)結(jié)果。肝臟中參與肝纖維化發(fā)展的許多類型的細(xì)胞已經(jīng)得到確認(rèn)［7］。簡(jiǎn)單地說(shuō)，受損的肝細(xì)胞(主要是受損的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞)，產(chǎn)生多種介質(zhì)，如活性氧和促纖維化細(xì)胞因子，啟動(dòng)肝星狀細(xì)胞(HSC)和/或其他促纖維化細(xì)胞的活化和增殖，生產(chǎn)過(guò)量的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)［8］。ECM 沉積增加主要原因是活化的HSC 生產(chǎn)基質(zhì)蛋白的增加。ECM 積聚及其蛋白質(zhì)組成的深刻變化，反過(guò)來(lái)又可以進(jìn)一步促進(jìn)HSC 的活化和增殖，從而加劇纖維化的進(jìn)展［7］。

如上所述，在細(xì)胞水平上，肝星狀細(xì)胞被認(rèn)為是肝纖維化發(fā)展中的關(guān)鍵角色。因此，體外肝纖維化模型中最常用的是靜態(tài)肝星狀細(xì)胞的分離及其在塑料培養(yǎng)皿含血清培養(yǎng)基中的培養(yǎng)。在這些條件下，細(xì)胞開(kāi)始一個(gè)表型轉(zhuǎn)分化的過(guò)程，該過(guò)程與響應(yīng)于慢性肝損傷的肝臟中出現(xiàn)活化肌成纖維細(xì)胞表型的過(guò)程類似，特別是當(dāng)培養(yǎng)基中存在Kupffer 細(xì)胞時(shí)(作為次要的雜質(zhì))［9］。一旦細(xì)胞激活為肌成纖維細(xì)胞的表型，細(xì)胞在隨后的傳代中仍保持肌成纖維細(xì)胞表型。在可能的情況下，細(xì)胞檢查應(yīng)在原初代培養(yǎng)中使用，因?yàn)檫@期間是唯一來(lái)檢查轉(zhuǎn)分化的影響時(shí)間。

需要注意的是，實(shí)驗(yàn)室方案的差異可能會(huì)導(dǎo)致在肝肌成纖維細(xì)胞性質(zhì)的差異，或肝星狀細(xì)胞衍生的肌成纖維細(xì)胞可能會(huì)被匯管區(qū)肌成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)所代替［8］。而且目前沒(méi)有靜態(tài)肝星狀細(xì)胞群的公認(rèn)診斷標(biāo)志物，可用于確認(rèn)細(xì)胞的特性和純度。盡管如此，體外培養(yǎng)系統(tǒng)將仍然是一個(gè)寶貴的工具，用于研究肝纖維化，可以很容易地用于高通量篩選實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)潛在的抗纖維化藥物。

一個(gè)技術(shù)上更具挑戰(zhàn)性的體外模型是肝臟切片的培養(yǎng)［10，11］。從正?；虿∽兊母闻K得到的肝片將保留其原生的細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞的接觸和細(xì)胞密度，這是一個(gè)有價(jià)值用于短期研究的模型。然而，即使是最薄的組織切片(約200 μm厚，10 個(gè)細(xì)胞厚)要保證營(yíng)養(yǎng)能夠有效地到達(dá)薄片組織的大部分細(xì)胞，特別是肝細(xì)胞，也是很難的，所以一般在培養(yǎng)24 h 后死亡［12，13］。

嚙齒動(dòng)物來(lái)源的肝星狀細(xì)胞很容易地培養(yǎng)許多代，因此，如果只是研究促纖維化狀態(tài)的肌纖維母細(xì)胞，永生細(xì)胞株往往不是必需的。要研究自靜止?fàn)顟B(tài)開(kāi)始的轉(zhuǎn)分化過(guò)程，細(xì)胞需要反復(fù)從動(dòng)物中分離，因?yàn)榧〕衫w維細(xì)胞不容易恢復(fù)到靜止?fàn)顟B(tài)。嚙齒類動(dòng)物的肝星狀細(xì)胞株的價(jià)值在于它們?nèi)菀妆粯?gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室直接進(jìn)行人體實(shí)驗(yàn)很困難，所以使用人肝星狀細(xì)胞系是比較常見(jiàn)的。此外，大多數(shù)人的肌成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)2 ～5 代后，便出現(xiàn)衰老(58 份來(lái)自人的培養(yǎng)樣品，只有2 份樣品能夠傳代培養(yǎng)5 代以上)。部分原因可能是分離的細(xì)胞主要來(lái)自老年患者(主要是從患有肝臟繼發(fā)性腫瘤的患者得到的部分肝切除標(biāo)本)。

人類肌成纖維細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染也有一定抵抗，對(duì)于一系列報(bào)告基因的構(gòu)建質(zhì)粒，只有核轉(zhuǎn)染才足夠有效［14］。病毒載體已被證明在感染細(xì)胞方面具有較高的效率，這些載體包括腺病毒［15，16］，逆轉(zhuǎn)錄病毒［17］與桿狀病毒［18］。雖然報(bào)告證實(shí)它們是有效的，產(chǎn)生重組載體所需資源的缺乏可能是導(dǎo)致它們難以得到廣泛使用的原因。

目前，體外模型系統(tǒng)仍然是一個(gè)有效來(lái)篩選大量潛在化合藥物的方法，尤其是在早期階段，為藥物調(diào)節(jié)纖維化過(guò)程的能力提供各種靶點(diǎn)。然而，很多體外系統(tǒng)也有局限性，這些局限阻礙了對(duì)于抗纖維化劑的識(shí)別，不能達(dá)到100%的準(zhǔn)確性。體外系統(tǒng)是一個(gè)封閉孤立的人工體系，不能像整體研究一樣，可以研究藥物的吸收，分布，代謝和排泄。在體內(nèi)肝肌成纖維細(xì)胞緊挨機(jī)體的主要藥物代謝細(xì)胞，但是體外系統(tǒng)缺乏這些。因此，仍需要將體外模型更換為體內(nèi)動(dòng)物模型來(lái)做進(jìn)一步的研究，體內(nèi)動(dòng)物模型在肝纖維化的研究中發(fā)揮著無(wú)可替代的作用。

［1］ FRIEDMAN S L. Mechanisms of Hepatic Fibrogenesis［J］. Gastroenterology，2008，134(6):1655-1669.

［2］ STARKEL P，LECLERCQ I A. Animal Models for the Study of Hepatic Fibrosis［J］. Best Practice ＆ Research Clinical Gastroenterology，2011，25(2):319-333.

［3］ VAN DE BOVENKAMP M，GROOTHUIS G M，MEIJER D K，et al.Liver Fibrosis in Vitro:Cell Culture Models and Precision-cut Liver Slices［J］. Toxicology in Vitro :an International Journal Published in Association with BIBRA，2007，21(4):545-557.

［4］ 吳 麗，魏 偉.肝纖維化的動(dòng)物模型及治療藥物研究［J］. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2004，20(5):481-485.

［5］ MAREK C J，TUCKER S J，KONSTANTINOU D K，et al. Pregnenolone-16α-carbonitrile Inhibits Rodent Liver Fibrogenesis Via PXR (pregnane X receptor)-Dependent and PXR-independent Mechanisms［J］. Biochemical Journal，2005，387(3):601.

［6］ 鄺滿元，劉映霞，李映菊. 肝纖維化動(dòng)物模型造模方法的研究進(jìn)展［J］. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，8(9):1768-1770.

［7］ WALLACE K，BURT A D，WRIGHT M C. Liver Fibrosis［J］. The Biochemical Journal，2008，411(1):1-18.

［8］ GUYOT C，LEPREUX S，COMBE C，et al. Hepatic Fibrosis and Cirrhosis:the (myo)Fibroblastic Cell Subpopulations Involved ［J］.The International Journal of Biochemistry ＆ Cell Biology，2006，38(2):135.

［9］ DE MINICIS S，SEKI E，UCHINAMI H，et al. Gene Expression Profiles during Hepatic Stellate Cell Activation in Culture and in Vivo［J］. Gastroenterology，2007，132(5):1937-1946.

［10］ VERRILL C，DAVIES J，MILLWARD－SADLER H，et al. Organotypic Liver Culture in a Fluid-air Interface Using Slices of Neonatal Rat and Adult Human Tissue-a Model of Fibrosis in Vitro［J］. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods，2002，48(2):103－110.

［11］ HAGENS W I，OLINGA P，MEIJER D K F，et al. Gliotoxin Nonselectively Induces Apoptosis in Fibrotic and Normal livers［J］. Liver International，2006，26(2):232-239.

［12］ WRIGHT M C，PAINE A J. Evidence that the Loss of Rat Liver Cytochrome P450 in Vitro is not Solely Associated with the Use of Collagenase，the Loss of Cell-cell Contacts and/or the Absence of an Extracellular Matrix ［J］. Biochemical Pharmacology，1992，43(2):237-243.

［13］ WRIGHT M，PAINE A. Resistance of Precision-cut Liver Slices to the Toxic Effects of Menadione［J］. Toxicology in vitro，1992，6(5):475-481.

［14］ HAUGHTON E L，TUCKER S J，MAREK C J，et al. Pregnane X Receptor Activators Inhibit Human Hepatic Stellate Cell Transdifferentiation in Vitro［J］. Gastroenterology，2006，131(1):194-209.

［15］ ABRISS B，HOLLWEG G，GRESSNER A M，et al. Adenoviralmediated Transfer of p53 or Retinoblastoma Protein Blocks Cell Proliferation and Induces Apoptosis in Culture-activated Hepatic Stellate Cells［J］. Journal of Hepatology，2003，38(2):169-178.

［16］ KINOSHITA K，IIMURO Y，F(xiàn)UJIMOTO J，et al. Targeted and Regulable Expression of Transgenes in Hepatic Stellate Cells and Myofibroblasts in Culture and in Vivo Using an Adenoviral Cre/loxP System to Antagonise Hepatic Fibrosis ［J］. Gastroenterology ＆Hepatology，2007，56(3):396-404.

［17］ OLASO E，IKEDA K，ENG F J，et al. DDR2 Receptor Promotes MMP-2 Mediated Proliferation and Invasion by Hepatic Stellate Cells［J］. Journal of Clinical Investigation，2001，108(9):1369-1394.

［18］ GAO R，MCCORMICK C J，ARTHUR M J P，et al. High Efficiency Gene Transfer into Cultured Primary Rat and Human Hepatic Stellate Cells Using Baculovirus Vectors［J］. Liver，2002，22(1):15-22.