乙型肝炎病毒表面大蛋白的研究進展

陳 勇 綜述，胡毓安 審校

(本文編輯:張仲書)

中國是乙型肝炎發(fā)病率較高的國家，HBsAg陽性率約 10.2%［1］，乙型肝炎病毒感染流行率為57.6%［2］。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是嚴(yán)重危害人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題，全世界有3.5億～4億感染者。每年因HBV感染死亡的人數(shù)為 100萬 ～200萬［3-5］。我國感染過HBV的人口中，慢性攜帶者占9.75%［6］。目前主要采取檢測HBV DNA載量的方法來評估乙肝病毒復(fù)制情況，但許多基層醫(yī)療機構(gòu)不具備核酸檢測的能力。因此，尋找一種新的、可靠的血清學(xué)指標(biāo)勢在必行。血清乙型肝炎病毒表面大蛋白(hepatitis B virus large surface protein，HBV-LP)的檢測是近年來研究較多的一個新的診療指標(biāo)。隨著對其基礎(chǔ)研究的深入，其血清檢測的臨床應(yīng)用研究亦越來越被臨床工作者所重視?，F(xiàn)將HBV-LP的結(jié)構(gòu)特點、生物學(xué)功能、作用機制及其臨床應(yīng)用的研究進展綜述如下。

1 HBV-LP的結(jié)構(gòu)特點

乙型肝炎病毒包膜蛋白由HBV-DNA的S區(qū)編碼合成，包括主蛋白(即HBsAg)、中蛋白(M蛋白即HBsAg和 PreS2)和大蛋白(即 HBsAg、preS1和preS2)［7-8］。新近的研究表明，HBV-LP的前 S蛋白具有獨特的雙重跨膜構(gòu)象拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，與HBV的感染、復(fù)制及預(yù)后密切相關(guān)［9-11］。該拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)由preSl、preS2和S結(jié)構(gòu)域組成。在病毒粒子成熟與分泌過程中，大蛋白preS結(jié)構(gòu)域開始時均位于胞質(zhì)內(nèi)(i-preS)，通過蛋白S的跨膜折疊區(qū)域在N端的I型及內(nèi)部Ⅱ型信號和疏水C端跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，大約一半大蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在翻譯后發(fā)生了重折疊，使得preS區(qū)域轉(zhuǎn)移進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的腔內(nèi)一側(cè)(e-preS)，從而產(chǎn)生大蛋白的獨特的雙重跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。雙重跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)是HBV-LP發(fā)揮多種生物學(xué)功能作用的依賴性結(jié)構(gòu)。HBV-LP上的preS區(qū)AA99-169(橫跨部分preS1和preS2及其銜接區(qū))形成一個環(huán)狀Loop區(qū)，具有眾多的免疫表位［12］。

2 HBV-LP的生物學(xué)功能

HBV-LP存在于感染性顆粒(Dane顆粒)和亞病毒管狀顆粒上，是病毒形成完整外膜的重要標(biāo)志，與病毒復(fù)制、病毒顆粒組裝和從細(xì)胞內(nèi)釋放調(diào)節(jié)密切相關(guān)［13］。HBV-LP在病毒復(fù)制過程中起關(guān)鍵性作用，也依賴于其獨特的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。它獨特的雙重跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)使其在病毒生活周期中執(zhí)行了兩個重要功能：①e-preS結(jié)構(gòu)域暴露在病毒粒子的表面，通過preSl的N末端區(qū)域作為配體與病毒受體結(jié)合；②ipreS結(jié)構(gòu)域作為基質(zhì)蛋白在病毒粒子形成的出芽過程中，通過其中103位精氨酸和124位絲氮酸之間或92～113位氨基酸之間(與病毒基因型有關(guān))的preS區(qū)域直接與核殼相互作用，同時介導(dǎo)HBsAg亞病毒顆粒的細(xì)胞質(zhì)滯留［14］。這是病毒粒子形成所必須的，該區(qū)域的小氨基酸的替換會阻斷病毒粒子的形成［15］。因此將preS區(qū)作為—個整體來進行功能研究會更有意義。但是HBV-LP的N端含有細(xì)胞內(nèi)滯留信號肽，具有細(xì)胞內(nèi)滯留性，在體外難以基因重組表達(dá)，同時該HBV-LP極容易降解，故以往將HBV-LP的preS區(qū)作為一個整體來進行功能研究相對較少。近年，通過蛋白修飾等技術(shù)，已經(jīng)可以完整表達(dá)HBV-LP或其preS抗原。完整HBV-LP或其preS區(qū)具有更為天然的構(gòu)象，多個疫苗和藥物研究均基于此。除了以上功能外，最近的研究表明preS1蛋白具有反式調(diào)節(jié)作用［16］。研究發(fā)現(xiàn)HBV-LP反式調(diào)節(jié)作用與病毒復(fù)制具有密切關(guān)系，亞病毒顆粒能顯著增強細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制和基因表達(dá)，更重要的是亞病毒顆粒的preS蛋白能觸發(fā)該增強效應(yīng)［17-19］。有實驗表明這種增強作用由preS蛋白的反式激活功能所活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所引發(fā)，表明含HBV的血清感染性不僅依賴于感染性病毒顆粒的數(shù)量，還與不含核酸的亞病毒顆粒的數(shù)量息息相關(guān)，特別是與HBV-LP上的preS蛋白相關(guān)［20-21］。這個研究具有重要的臨床意義。preS2蛋白由55個氨基酸殘基組成，不僅存在于病毒顆粒表面，亦可出現(xiàn)在非傳染性球形顆粒表面，具有調(diào)節(jié)對表面蛋白的免疫應(yīng)答及控制病毒顆粒裝配等功能，可促進病毒免疫清除。PreS2蛋白已被證明具有很強的反式調(diào)節(jié)作用，可以與蛋白激酶C(PKC)α/β結(jié)合，發(fā)生磷酸化反應(yīng)觸發(fā)了PKC依賴的c-Raf-1/MPKKK(絲裂激活蛋白激酶激酶激酶)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，從而激活轉(zhuǎn)錄子，如激活蛋白-1(AP-1)、細(xì)胞核因子-κB(NK-κB)、激活蛋白-2(AP-2)、血清應(yīng)答因子(SRF)、Sp1和c-myc、c-fos啟動子，參與病毒感染后的炎癥和肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生［22］。

3 HBV-LP的反式調(diào)節(jié)作用機制

HBV進入肝細(xì)胞后，可以與肝細(xì)胞染色體整合并編碼兩種反式調(diào)節(jié)因子：preS2反式調(diào)節(jié)因子家族和HBV-LP和羧基端截短型中蛋白(MHBst)。HBV-LP的反式激活作用與其獨特的雙重跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)密切相關(guān)，其preS1和preS2區(qū)有一個與翻譯不同步的轉(zhuǎn)位過程，在橫跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜時是指向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的胞質(zhì)側(cè)，這種在胞質(zhì)滯留的preS2區(qū)，有機會與細(xì)胞中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)因子相互作用，發(fā)揮其反式激活作用，另有一部分HBV-LP的preS1和preS2區(qū)在翻譯后轉(zhuǎn)位跨過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，進入分泌途徑，參與病毒顆粒的組裝［23-25］。MHBst是變異的病毒表面抗原中蛋白，缺失了位于C末端的膜定位信號，使MHBst具備內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)定位功能，不進入分泌途徑而在ER滯留，其preS2區(qū)指向胞漿區(qū)，從而有機會與胞漿蛋白相互作用，發(fā)揮廣泛的反式激活效應(yīng)［26］。

4 HBV-LP的臨床應(yīng)用

HBV-LP采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測，操作簡便，無需特殊設(shè)備，對實驗室的要求不高，一般實驗室均可開展，所以近年來相關(guān)研究較多。臨床上主要以肝功能改善、HBeAg血清轉(zhuǎn)陰和 HBV DNA陰轉(zhuǎn)作為近期抗病毒治療終點目標(biāo)的監(jiān)測指標(biāo)。但臨床上很少有乙肝病例能夠達(dá)到臨床治愈標(biāo)準(zhǔn)，即使達(dá)到了臨床治愈標(biāo)準(zhǔn)其肝臟組織內(nèi)仍持續(xù)有HBV感染，還能檢測出共價閉合環(huán)狀HBV DNA(cccHBV DNA)［27］。由于持續(xù)免疫抑制、長期治療，致使 HBV基因前 C區(qū)和 CP區(qū)變異，導(dǎo)致HBeAg合成障礙［28］。故HBeAg陰轉(zhuǎn)并不能排除病毒的感染與復(fù)制。血清為低水平HBV DNA時肝內(nèi)DNA仍能維持一定水平，因此血清HBV DNA檢測陰性并不意味著病毒已完全清除。以往通過針對preSl蛋白線性表位制備的單克隆抗體檢測血清HBV-LP，已有研究表明preSl前端的第2位甘氨酸殘基發(fā)生豆蔻酰基化，導(dǎo)致preSl前端插入磷脂層，形成一個立體構(gòu)象的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，使得preS1片段并不完全暴露于病毒表面，而造成preS1不能有效被檢測［29-30］。此外還有研究證明HBV-LP的反式激活作用位于HBV-LP的 preS2區(qū)［31］。因此檢測HBVLP的臨床意義涵蓋了preS1和preS2。作為HBVLP一部分的呈線性結(jié)構(gòu)的HBV preSl、HBV preS2抗原是較HBeAg敏感的可反映HBV感染與復(fù)制的血清學(xué)指標(biāo)，出現(xiàn)在病毒感染的早期，其陰轉(zhuǎn)是病毒清除的最早跡象，若持續(xù)陽性則提示感染慢性化和疾病持續(xù)活動。血清HBV-LP檢測判斷HBV完整外膜的存在，代表著病毒基因或亞病毒顆粒的存在。國內(nèi)有報道［32-33］血清HBV-LP是新的反映HBV感染者體內(nèi)病毒復(fù)制的血清學(xué)監(jiān)測指標(biāo)，且較HBVDNA、HBeAg、preS1、preS2 均敏感，具有較高的敏感度、特異度與準(zhǔn)確度，是對HBV檢測有益的補充。魏紅山等［34］報道血清HBV-LP檢測是監(jiān)測HBeAg陰性和低水平DNA的HBV感染者體內(nèi)病毒復(fù)制程度、疾病進展、療效與預(yù)后判斷的血清學(xué)敏感指標(biāo)，并有助于鑒別HBeAg陰性活動期肝炎，監(jiān)測低水平HBV DNA患者的疾病進展與抗病毒治療療效，彌補HBV DNA監(jiān)測的不足［35］，提高臨床HBV感染者的實驗診斷與治療水平。

綜上所述，HBV-LP檢測能反映乙型肝炎病毒復(fù)制狀態(tài)，為臨床提供了一個新的監(jiān)測HBV感染者體內(nèi)病毒復(fù)制、疾病進展、抗病毒療效、肝細(xì)胞損傷與預(yù)后的血清學(xué)敏感指標(biāo)。合理開展HBV-LP檢測，有助于提高HBV感染者的血清學(xué)診斷的準(zhǔn)確性及臨床診治水平，在乙型肝炎的治療預(yù)后中具有重要的臨床應(yīng)用價值。

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