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      乙型肝炎病毒表面大蛋白的研究進展

      2013-08-15 00:42:51綜述胡毓安審校
      東南國防醫(yī)藥 2013年4期
      關(guān)鍵詞:跨膜反式乙型肝炎

      陳 勇 綜述,胡毓安 審校

      (本文編輯:張仲書)

      中國是乙型肝炎發(fā)病率較高的國家,HBsAg陽性率約 10.2%[1],乙型肝炎病毒感染流行率為57.6%[2]。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是嚴(yán)重危害人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題,全世界有3.5億~4億感染者。每年因HBV感染死亡的人數(shù)為 100萬 ~200萬[3-5]。我國感染過HBV的人口中,慢性攜帶者占9.75%[6]。目前主要采取檢測HBV DNA載量的方法來評估乙肝病毒復(fù)制情況,但許多基層醫(yī)療機構(gòu)不具備核酸檢測的能力。因此,尋找一種新的、可靠的血清學(xué)指標(biāo)勢在必行。血清乙型肝炎病毒表面大蛋白(hepatitis B virus large surface protein,HBV-LP)的檢測是近年來研究較多的一個新的診療指標(biāo)。隨著對其基礎(chǔ)研究的深入,其血清檢測的臨床應(yīng)用研究亦越來越被臨床工作者所重視?,F(xiàn)將HBV-LP的結(jié)構(gòu)特點、生物學(xué)功能、作用機制及其臨床應(yīng)用的研究進展綜述如下。

      1 HBV-LP的結(jié)構(gòu)特點

      乙型肝炎病毒包膜蛋白由HBV-DNA的S區(qū)編碼合成,包括主蛋白(即HBsAg)、中蛋白(M蛋白即HBsAg和 PreS2)和大蛋白(即 HBsAg、preS1和preS2)[7-8]。新近的研究表明,HBV-LP的前 S蛋白具有獨特的雙重跨膜構(gòu)象拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),與HBV的感染、復(fù)制及預(yù)后密切相關(guān)[9-11]。該拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)由preSl、preS2和S結(jié)構(gòu)域組成。在病毒粒子成熟與分泌過程中,大蛋白preS結(jié)構(gòu)域開始時均位于胞質(zhì)內(nèi)(i-preS),通過蛋白S的跨膜折疊區(qū)域在N端的I型及內(nèi)部Ⅱ型信號和疏水C端跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜,大約一半大蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在翻譯后發(fā)生了重折疊,使得preS區(qū)域轉(zhuǎn)移進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的腔內(nèi)一側(cè)(e-preS),從而產(chǎn)生大蛋白的獨特的雙重跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。雙重跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)是HBV-LP發(fā)揮多種生物學(xué)功能作用的依賴性結(jié)構(gòu)。HBV-LP上的preS區(qū)AA99-169(橫跨部分preS1和preS2及其銜接區(qū))形成一個環(huán)狀Loop區(qū),具有眾多的免疫表位[12]。

      2 HBV-LP的生物學(xué)功能

      HBV-LP存在于感染性顆粒(Dane顆粒)和亞病毒管狀顆粒上,是病毒形成完整外膜的重要標(biāo)志,與病毒復(fù)制、病毒顆粒組裝和從細(xì)胞內(nèi)釋放調(diào)節(jié)密切相關(guān)[13]。HBV-LP在病毒復(fù)制過程中起關(guān)鍵性作用,也依賴于其獨特的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。它獨特的雙重跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)使其在病毒生活周期中執(zhí)行了兩個重要功能:①e-preS結(jié)構(gòu)域暴露在病毒粒子的表面,通過preSl的N末端區(qū)域作為配體與病毒受體結(jié)合;②ipreS結(jié)構(gòu)域作為基質(zhì)蛋白在病毒粒子形成的出芽過程中,通過其中103位精氨酸和124位絲氮酸之間或92~113位氨基酸之間(與病毒基因型有關(guān))的preS區(qū)域直接與核殼相互作用,同時介導(dǎo)HBsAg亞病毒顆粒的細(xì)胞質(zhì)滯留[14]。這是病毒粒子形成所必須的,該區(qū)域的小氨基酸的替換會阻斷病毒粒子的形成[15]。因此將preS區(qū)作為—個整體來進行功能研究會更有意義。但是HBV-LP的N端含有細(xì)胞內(nèi)滯留信號肽,具有細(xì)胞內(nèi)滯留性,在體外難以基因重組表達(dá),同時該HBV-LP極容易降解,故以往將HBV-LP的preS區(qū)作為一個整體來進行功能研究相對較少。近年,通過蛋白修飾等技術(shù),已經(jīng)可以完整表達(dá)HBV-LP或其preS抗原。完整HBV-LP或其preS區(qū)具有更為天然的構(gòu)象,多個疫苗和藥物研究均基于此。除了以上功能外,最近的研究表明preS1蛋白具有反式調(diào)節(jié)作用[16]。研究發(fā)現(xiàn)HBV-LP反式調(diào)節(jié)作用與病毒復(fù)制具有密切關(guān)系,亞病毒顆粒能顯著增強細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制和基因表達(dá),更重要的是亞病毒顆粒的preS蛋白能觸發(fā)該增強效應(yīng)[17-19]。有實驗表明這種增強作用由preS蛋白的反式激活功能所活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所引發(fā),表明含HBV的血清感染性不僅依賴于感染性病毒顆粒的數(shù)量,還與不含核酸的亞病毒顆粒的數(shù)量息息相關(guān),特別是與HBV-LP上的preS蛋白相關(guān)[20-21]。這個研究具有重要的臨床意義。preS2蛋白由55個氨基酸殘基組成,不僅存在于病毒顆粒表面,亦可出現(xiàn)在非傳染性球形顆粒表面,具有調(diào)節(jié)對表面蛋白的免疫應(yīng)答及控制病毒顆粒裝配等功能,可促進病毒免疫清除。PreS2蛋白已被證明具有很強的反式調(diào)節(jié)作用,可以與蛋白激酶C(PKC)α/β結(jié)合,發(fā)生磷酸化反應(yīng)觸發(fā)了PKC依賴的c-Raf-1/MPKKK(絲裂激活蛋白激酶激酶激酶)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),從而激活轉(zhuǎn)錄子,如激活蛋白-1(AP-1)、細(xì)胞核因子-κB(NK-κB)、激活蛋白-2(AP-2)、血清應(yīng)答因子(SRF)、Sp1和c-myc、c-fos啟動子,參與病毒感染后的炎癥和肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生[22]。

      3 HBV-LP的反式調(diào)節(jié)作用機制

      HBV進入肝細(xì)胞后,可以與肝細(xì)胞染色體整合并編碼兩種反式調(diào)節(jié)因子:preS2反式調(diào)節(jié)因子家族和HBV-LP和羧基端截短型中蛋白(MHBst)。HBV-LP的反式激活作用與其獨特的雙重跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)密切相關(guān),其preS1和preS2區(qū)有一個與翻譯不同步的轉(zhuǎn)位過程,在橫跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜時是指向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的胞質(zhì)側(cè),這種在胞質(zhì)滯留的preS2區(qū),有機會與細(xì)胞中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)因子相互作用,發(fā)揮其反式激活作用,另有一部分HBV-LP的preS1和preS2區(qū)在翻譯后轉(zhuǎn)位跨過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜,進入分泌途徑,參與病毒顆粒的組裝[23-25]。MHBst是變異的病毒表面抗原中蛋白,缺失了位于C末端的膜定位信號,使MHBst具備內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)定位功能,不進入分泌途徑而在ER滯留,其preS2區(qū)指向胞漿區(qū),從而有機會與胞漿蛋白相互作用,發(fā)揮廣泛的反式激活效應(yīng)[26]。

      4 HBV-LP的臨床應(yīng)用

      HBV-LP采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測,操作簡便,無需特殊設(shè)備,對實驗室的要求不高,一般實驗室均可開展,所以近年來相關(guān)研究較多。臨床上主要以肝功能改善、HBeAg血清轉(zhuǎn)陰和 HBV DNA陰轉(zhuǎn)作為近期抗病毒治療終點目標(biāo)的監(jiān)測指標(biāo)。但臨床上很少有乙肝病例能夠達(dá)到臨床治愈標(biāo)準(zhǔn),即使達(dá)到了臨床治愈標(biāo)準(zhǔn)其肝臟組織內(nèi)仍持續(xù)有HBV感染,還能檢測出共價閉合環(huán)狀HBV DNA(cccHBV DNA)[27]。由于持續(xù)免疫抑制、長期治療,致使 HBV基因前 C區(qū)和 CP區(qū)變異,導(dǎo)致HBeAg合成障礙[28]。故HBeAg陰轉(zhuǎn)并不能排除病毒的感染與復(fù)制。血清為低水平HBV DNA時肝內(nèi)DNA仍能維持一定水平,因此血清HBV DNA檢測陰性并不意味著病毒已完全清除。以往通過針對preSl蛋白線性表位制備的單克隆抗體檢測血清HBV-LP,已有研究表明preSl前端的第2位甘氨酸殘基發(fā)生豆蔻酰基化,導(dǎo)致preSl前端插入磷脂層,形成一個立體構(gòu)象的環(huán)狀結(jié)構(gòu),使得preS1片段并不完全暴露于病毒表面,而造成preS1不能有效被檢測[29-30]。此外還有研究證明HBV-LP的反式激活作用位于HBV-LP的 preS2區(qū)[31]。因此檢測HBVLP的臨床意義涵蓋了preS1和preS2。作為HBVLP一部分的呈線性結(jié)構(gòu)的HBV preSl、HBV preS2抗原是較HBeAg敏感的可反映HBV感染與復(fù)制的血清學(xué)指標(biāo),出現(xiàn)在病毒感染的早期,其陰轉(zhuǎn)是病毒清除的最早跡象,若持續(xù)陽性則提示感染慢性化和疾病持續(xù)活動。血清HBV-LP檢測判斷HBV完整外膜的存在,代表著病毒基因或亞病毒顆粒的存在。國內(nèi)有報道[32-33]血清HBV-LP是新的反映HBV感染者體內(nèi)病毒復(fù)制的血清學(xué)監(jiān)測指標(biāo),且較HBVDNA、HBeAg、preS1、preS2 均敏感,具有較高的敏感度、特異度與準(zhǔn)確度,是對HBV檢測有益的補充。魏紅山等[34]報道血清HBV-LP檢測是監(jiān)測HBeAg陰性和低水平DNA的HBV感染者體內(nèi)病毒復(fù)制程度、疾病進展、療效與預(yù)后判斷的血清學(xué)敏感指標(biāo),并有助于鑒別HBeAg陰性活動期肝炎,監(jiān)測低水平HBV DNA患者的疾病進展與抗病毒治療療效,彌補HBV DNA監(jiān)測的不足[35],提高臨床HBV感染者的實驗診斷與治療水平。

      綜上所述,HBV-LP檢測能反映乙型肝炎病毒復(fù)制狀態(tài),為臨床提供了一個新的監(jiān)測HBV感染者體內(nèi)病毒復(fù)制、疾病進展、抗病毒療效、肝細(xì)胞損傷與預(yù)后的血清學(xué)敏感指標(biāo)。合理開展HBV-LP檢測,有助于提高HBV感染者的血清學(xué)診斷的準(zhǔn)確性及臨床診治水平,在乙型肝炎的治療預(yù)后中具有重要的臨床應(yīng)用價值。

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