運(yùn)用組織工程技術(shù)修復(fù)眼表?yè)p害的研究進(jìn)展

張毓敏

(武警北京總隊(duì)三師第二支隊(duì)衛(wèi)生隊(duì)100081)

正常的眼表是由結(jié)膜和角膜上皮組成的，這兩種上皮具有不同的細(xì)胞表型。其中，完整的角膜上皮對(duì)維持角膜的屏障功能，屈光功能及透明性起著關(guān)鍵作用。角膜上皮是一種能夠不斷自我更新的組織，其完整性的維持依賴于角膜緣干細(xì)胞的不斷增殖［1］。同時(shí)，角膜緣作為一種屏障可阻止結(jié)膜血管侵入，對(duì)角膜透明狀態(tài)及其正常視功能的維持具有重要意義。當(dāng)角膜的完整性遭到化學(xué)傷及熱燒傷、輻射損傷、微生物感染等因素的破壞以致角膜緣干細(xì)胞嚴(yán)重缺乏或功能障礙時(shí)，會(huì)出現(xiàn)角膜的"結(jié)膜化":結(jié)膜上皮增生移行、角膜上皮持續(xù)缺損、基質(zhì)瘢痕、新生血管形成、杯狀細(xì)胞出現(xiàn)，對(duì)患者視力造成嚴(yán)重的威脅。為了挽救上述嚴(yán)重的眼表?yè)p害，研究者已經(jīng)嘗試多種方法進(jìn)行眼表重建。

1.眼表?yè)p害既往治療方法

(1)自體組織移植:①結(jié)膜移植術(shù):通過自體結(jié)膜移植修復(fù)單側(cè)眼化學(xué)傷;②角膜緣移植術(shù):采用自體的角膜緣組織進(jìn)行移植，取得很好的療效。但由于自體組織取材量有限，故僅適用于單眼或雙眼局限性角膜緣受損的病例。而且健康組織缺損引起的損害亦不能忽視，所以這并不是最佳的治療方法。

(2)同種異體組織移植:由于異體角膜緣移植術(shù)存在排斥反應(yīng)而限制了其運(yùn)用。此外，角膜緣移植的成功率還取決于角膜基質(zhì)的微環(huán)境。雖然這一療法克服了自體組織移植的供量有限等缺點(diǎn)，但由于移植后的免疫排斥反應(yīng)尚不能完全克服，需長(zhǎng)期使用免疫抑制劑，再加上供體來源的限制，以及醫(yī)學(xué)倫理學(xué)方面的障礙，至今尚未能廣泛用于臨床。

2.組織工程學(xué)在眼科學(xué)的應(yīng)用及進(jìn)展:運(yùn)用組織工程技術(shù)制備工程化角膜上皮為眼表?yè)p害的治療帶來了新的思路。將活細(xì)胞與可降解支架材料結(jié)合，在體外構(gòu)建有生命的種植體，植入體內(nèi)修復(fù)組織缺損，重建功能，以達(dá)到治療疾病目的的一門新興學(xué)科［3－4］。

(1)組織工程角膜上皮

1)通過體外培養(yǎng)擴(kuò)增的方法獲得足夠量的種子細(xì)胞，種植于一種生物相容性良好的載體上復(fù)合成組織工程化角膜上皮，移植到患者眼表治療眼表?yè)p害。理想的種子細(xì)胞應(yīng)有較強(qiáng)的增殖能力且能長(zhǎng)期保持其特有的生物特性。目前主要有三個(gè)來源:角膜緣干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和非眼表來源的上皮細(xì)胞。除了理想的種子細(xì)胞外，合適的支架材料也是組織工程化角膜上皮構(gòu)建成功的關(guān)鍵。材料必須滿足以下幾點(diǎn):①自身及其降解產(chǎn)物對(duì)機(jī)體無毒性;②具有優(yōu)良的生物相容性和組織相容性;③不引起排斥反應(yīng)和炎性反應(yīng);④在機(jī)體內(nèi)可逐漸降解吸收，降解和吸收的速度與組織細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖速度相匹配。目前用于組織工程化角膜上皮的支架材料主要分成天然載體和人工合成載體兩類。天然載體包括羊膜，角膜基質(zhì)，膠原等。人工合成載體包括聚乳酸(PLA)和聚羥基乙酸(PGA)、纖維蛋白等。

隨著對(duì)羊膜基礎(chǔ)研究的深入和顯微手術(shù)技術(shù)的提高，羊膜廣泛應(yīng)用于臨床眼表重建中。研究表明，羊膜在移植術(shù)后通過一些生長(zhǎng)因子如:皮生長(zhǎng)因子(EGF)，角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)等促進(jìn)上皮增生分化。

羊膜具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷徙和生長(zhǎng)的作用，從而抑制了角膜新生血管的發(fā)生。此外，羊膜材料易獲得，免疫原性低，具有抗微生物的特性和較強(qiáng)的抗粘附性，還可作為理想細(xì)胞載體。正是因?yàn)樯鲜鰞?yōu)點(diǎn)，羊膜已用于多種眼表疾患的治療和重建術(shù)中角膜上皮的缺損。近年來將角膜緣干細(xì)胞等種子細(xì)胞培養(yǎng)在羊膜上構(gòu)建羊膜角膜植片用于治療角膜緣干細(xì)胞缺失已有成功的報(bào)道并成為目前研究的熱點(diǎn)。

2)種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程化角膜上皮一個(gè)必要條件是理想的種子細(xì)胞。隨著對(duì)角膜緣干細(xì)胞研究的不斷深入，以角膜緣干細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程化角膜上皮的技術(shù)已經(jīng)比較成熟［2］。1997年，Pellegrini等［3］首次應(yīng)用角膜緣干細(xì)胞體外培養(yǎng)構(gòu)建角膜上皮組織對(duì)2例堿燒傷患者施行自體移植，隨訪2年，重建的角膜維持穩(wěn)定、透明，組織無血管化。Schwab［4］將自體角膜緣干細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增后，種植于羊膜上構(gòu)建角膜上皮，回植治療19例嚴(yán)重眼表皮損傷患者，效果良好。以LSCs作為種子細(xì)胞聯(lián)合適宜載體的移植術(shù)，在很大程度上解決了角膜移植材料不足的問題，而且大大降低了移植排斥反應(yīng)的發(fā)生，是治療干細(xì)胞缺乏的眼表疾病最有吸引力的方法之一。但是，這一治療手段不適用于那些雙眼嚴(yán)重受損，不存自體角膜緣移植來源的患者［5］。因此，許多研究者開始嘗試其他來源的細(xì)胞。這些細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞、口腔上皮細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞等［3］。

胚胎干細(xì)胞(ESC)來源于早期胚胎的多能干細(xì)胞，是一種體外培養(yǎng)時(shí)能維持正常核型，在一定條件下能誘導(dǎo)分化成各系統(tǒng)細(xì)胞的高度未分化細(xì)胞。ESC系確立，為許多組織器官的移植提供了可能，選取適宜載體利用胚胎干細(xì)胞作為種子細(xì)胞誘導(dǎo)分化為角膜緣干細(xì)胞或角膜上皮細(xì)胞已實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)性的眼表重建。

口腔粘膜上皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞治療眼表疾病已成為研究熱點(diǎn)。Nakamura等［6］將取自兔的口腔粘膜上皮細(xì)胞以羊膜為載體，進(jìn)行體外培養(yǎng)2～3周，組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)經(jīng)培養(yǎng)的兔口腔粘膜上皮細(xì)胞復(fù)合物有4～5層的復(fù)層上皮細(xì)胞、分化良好，外觀上與正常角膜上皮細(xì)胞相似。免疫組化分析顯示培養(yǎng)的口腔上皮細(xì)胞表達(dá)角膜特異性的角蛋白，具有非角化上皮的特征。電鏡觀察顯示以羊膜為載體培養(yǎng)的口腔上皮細(xì)胞具有與角膜上皮細(xì)胞相似的半橋粒，橋粒等對(duì)維持角膜上皮正常功能非常重要的特異性連接結(jié)構(gòu)。故采用體外培養(yǎng)口腔粘膜上皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞來重建眼表，是治療嚴(yán)重眼表疾病的新途徑之一。

(2)應(yīng)用:自體來源細(xì)胞構(gòu)建組織工程化角膜上皮可以避免異體移植的免疫反應(yīng);且由于細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增，因而取材量較小，對(duì)同側(cè)眼的健側(cè)象限或?qū)?cè)健眼不會(huì)造成較大的損傷。1997年，Pellegrini等［7］首次應(yīng)用角膜緣干細(xì)胞體外培養(yǎng)構(gòu)建角膜上皮組織對(duì)堿燒傷患者施行自體移植，隨訪2年，重建的角膜維持穩(wěn)定、透明，無血管化。隨后，Schwab［8］報(bào)道了將自體角膜緣干細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增后，種植于羊膜上構(gòu)建角膜上皮，回植治療19例嚴(yán)重眼表?yè)p害患者，效果良好。Tsai等［9］以羊膜為載體構(gòu)建組織工程化角膜上皮移植片進(jìn)行眼表重建也獲得成功。Nishida等［10］將自體口腔粘膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)移植重建眼表，發(fā)現(xiàn)術(shù)后一周所有患者角膜熒光素染色陰性、角膜恢復(fù)透明。在隨訪期14個(gè)月內(nèi)，角膜上皮保持穩(wěn)定并透明。

(3)可行性:以上皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞治療眼表疾病已成為研究熱點(diǎn)。與表皮角質(zhì)化細(xì)胞相比，自體上皮細(xì)胞處于較低的分化階段，體外培養(yǎng)時(shí)間較短，能夠較長(zhǎng)時(shí)間維持非角化狀態(tài)。此外，角蛋白K3是角膜分化形態(tài)的可靠標(biāo)志物，而研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)正常上皮細(xì)胞也表達(dá)該蛋白。免疫組化分析顯示培養(yǎng)的上皮細(xì)胞移植片表達(dá)角膜特異性的角蛋白K3，具有非角化上皮的特征。超微結(jié)構(gòu)方面，電鏡觀察顯示以羊膜為載體培養(yǎng)的上皮細(xì)胞具有與角膜上皮細(xì)胞相似的半橋粒，橋粒等對(duì)維持角膜上皮正常功能非常重要的特異性連接結(jié)構(gòu)。以上特征說明了體外構(gòu)建組織工程角膜上皮移植片為角膜上皮理想替代物用于眼表重建的可行性。

3.問題與展望:組織工程技術(shù)的發(fā)展，為治療嚴(yán)重眼表?yè)p害提供了新的思路。對(duì)各種眼表?yè)p害來說，運(yùn)用羊膜構(gòu)建角膜上皮移植片修復(fù)眼表是一種新的可行的治療方法。相比于異體角膜移植來說，避免了術(shù)后長(zhǎng)期應(yīng)用免疫制劑所產(chǎn)生的并發(fā)癥。然而，上皮細(xì)胞組織工程化角膜的研究尚處于起步階段。在雙眼干細(xì)胞缺失的情況下，用自體上皮細(xì)胞進(jìn)行眼表重建短期效果理想，但上皮細(xì)胞屬于成體細(xì)胞，終究會(huì)凋亡。這就對(duì)應(yīng)用上皮細(xì)胞進(jìn)行眼表重建的長(zhǎng)期效果和可行性提出了挑戰(zhàn)。此外，上皮細(xì)胞在載體上的固定、細(xì)胞的鑒定，以及影響上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)分裂，增殖的因素等問題仍需要進(jìn)一步研究以明確。但相信隨著各項(xiàng)工作的不斷深入，這些問題都會(huì)得到解決。

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