藥物靶點(diǎn)篩選的研究

崔大明

長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長(zhǎng)春 130117

20世紀(jì)90年代，隨著生命科學(xué)的發(fā)展和生物技術(shù)的進(jìn)步, 基于靶點(diǎn)的藥物發(fā)現(xiàn)模式逐漸取代了傳統(tǒng)的基于藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)模式，成為現(xiàn)代創(chuàng)新藥物研發(fā)的主流模式。本文主要總結(jié)了藥物靶點(diǎn)篩選的全部流程，并重點(diǎn)介紹了靶點(diǎn)確認(rèn)及驗(yàn)證的成熟方法。

1 藥物靶點(diǎn)篩選的三個(gè)階段

1.1 小分子藥物的篩選

藥物靶點(diǎn)的篩選首先要篩選感興趣的藥物，主要有兩種基本方式：基于靶點(diǎn)的篩選和表型篩選。

1.1.1 基于靶點(diǎn)的篩選 到目前為止，很多藥物都是通過(guò)這種方法篩選得到的，基于靶點(diǎn)的篩選可以有效的篩選到具有生物活性的小分子物質(zhì)，這種篩選方式定位于特定的靶蛋白，例如，激酶，組蛋白去乙?；富蛘呤荊蛋白偶聯(lián)受體。通過(guò)此方法篩選得到的小分子活性物質(zhì)對(duì)靶點(diǎn)的具有強(qiáng)烈的影響作用，但是，在有機(jī)體內(nèi)，它可能影響多種蛋白及信號(hào)通路而不僅僅是一個(gè)靶點(diǎn)或通路。在活體內(nèi)，一種蛋白的功能通過(guò)與另一種蛋白的相互作用而發(fā)揮，同樣的，小分子物質(zhì)因?yàn)槠浠瘜W(xué)性質(zhì)及與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制的固有連通性，因而具有多個(gè)靶點(diǎn)。所以，要想明確了解某個(gè)已選定的小分子物質(zhì)的活性，需要一個(gè)更綜合的行篩選方法例如表型篩選法。

1.1.2 表型篩選法 表型篩選法是一種綜合性的篩選方法，可以在細(xì)胞或者是生物體水平上評(píng)估某個(gè)小分子物質(zhì)的生物活性。

血管新生篩選包括細(xì)胞入侵和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）形成血管，當(dāng)用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子或者低氧的環(huán)境處理時(shí)，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）侵入到基質(zhì)中重建新的血管，而人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）也可以形成管狀結(jié)構(gòu)來(lái)穩(wěn)定新生的血管。如果某個(gè)小分子物質(zhì)抑制以上兩種現(xiàn)象且同樣抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的生長(zhǎng)，那此物質(zhì)就是一種潛在的血管生長(zhǎng)抑制劑。

自噬篩選包括對(duì)增多的自噬體的檢測(cè)[5]，通過(guò)酸性胞液染色標(biāo)記可以很容易的檢測(cè)到自噬體的存在，高內(nèi)涵篩選（HCS）可以量化活細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)目。此外，細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，生長(zhǎng)狀況及死亡情況都可以很容易的檢測(cè)到，自噬可以作為治療癌癥及動(dòng)脈粥樣硬化的潛在靶點(diǎn)。自噬電離劑（Autophagonizer），是近幾年通過(guò)表型篩選及后期的高內(nèi)涵篩選（HCS）得到的一種誘導(dǎo)細(xì)胞自我吞噬的小分子物質(zhì)，且它不會(huì)被部分已知的自噬抑制劑所抑制，它的作用機(jī)制似乎與雷帕霉素有所不同，雷帕霉素是通過(guò)抑制雷帕霉素靶蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞的自我吞噬，但是其作用靶點(diǎn)還有待研究。

表型篩選相對(duì)于傳統(tǒng)的基于靶點(diǎn)篩選具有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：①表型篩選是對(duì)全基因組的篩選，覆蓋了所有與所篩選表型有關(guān)的靶點(diǎn)及信號(hào)通路[6]。②表型篩選是在有機(jī)體及細(xì)胞水平下進(jìn)行的，吸收，分配，代謝，排泄因素都考慮在內(nèi)，但是經(jīng)此方法篩選后，對(duì)于藥物作用的靶點(diǎn)及通路是不明確的，需要后期進(jìn)一步的識(shí)別和驗(yàn)證。③與傳統(tǒng)的基于靶點(diǎn)的篩選相比，它不需要預(yù)先的假設(shè)及分析，這種篩選非常適合對(duì)機(jī)制不明的疾病的靶點(diǎn)的篩選。

2 靶點(diǎn)驗(yàn)證

多種靶點(diǎn)識(shí)別方法得到的藥物作用靶點(diǎn)只能作為靶點(diǎn)初步篩選的方法，之后需要對(duì)候選靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。第一步就是確認(rèn)此靶點(diǎn)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中是否調(diào)節(jié)化合物的生物活性?？梢酝ㄟ^(guò)RNA干擾技術(shù)沉默某一疾病的基因，形成缺乏特定靶標(biāo)的小鼠，看它是否具有普通小鼠藥物作用后的癥狀，或者將藥物注射到基因敲出的小鼠中，若藥物沒(méi)有引起效應(yīng)，說(shuō)明藥物是通過(guò)這一特定靶點(diǎn)作用的，因?yàn)楹蜻x靶點(diǎn)的同系物也要被納入考慮范圍即使其在最初的篩選中并沒(méi)有被識(shí)別，此外，一個(gè)物質(zhì)可能具有功能性獲得的活性，靶點(diǎn)的缺失會(huì)抑制此物質(zhì)的活性[15]。除了RNA干擾技術(shù)，也可以用cDNA過(guò)表達(dá)來(lái)建立藥物-靶點(diǎn)作用關(guān)系，這種方法類(lèi)似于酵母中的拷貝數(shù)抑制現(xiàn)象，靶點(diǎn)的過(guò)表達(dá)可能會(huì)抑制藥物的活性。這種方法對(duì)于驗(yàn)證膜靶點(diǎn)極為重要。

一旦假定的靶點(diǎn)通過(guò)功能實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，就需要對(duì)小分子物質(zhì)及靶點(diǎn)的親和力進(jìn)行量化。這一過(guò)程可以通過(guò)表面等離子共振或者等溫量熱法技術(shù)完成，如果假定的靶點(diǎn)是一種酶，則要通過(guò)酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)衡量此物質(zhì)的酶活力[16-17]。最后，需要通過(guò)NMR或共結(jié)晶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行更為嚴(yán)格的驗(yàn)證，進(jìn)而得到藥物-靶點(diǎn)復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)。這些信息不僅可以驗(yàn)證物理上的關(guān)聯(lián)性，也可以提供后期藥物優(yōu)化中結(jié)合模型的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)語(yǔ)

與傳統(tǒng)的基于靶點(diǎn)的篩選方法相比，表型篩選是一種篩選具有高潛力藥物靶點(diǎn)的快速有效方法。表型篩選是對(duì)全基因組的篩選，覆蓋了所有與所篩選表型有關(guān)的靶點(diǎn)及信號(hào)通路，吸收，分配，代謝，排泄因素都考慮在內(nèi)。這種篩選非常適合對(duì)機(jī)制不明的疾病的靶點(diǎn)的篩選。此方法篩選后，對(duì)于藥物作用的靶點(diǎn)及通路依然是不明確的，需要經(jīng)過(guò)后期對(duì)靶點(diǎn)的識(shí)別和驗(yàn)證。

經(jīng)過(guò)表型篩選后，需要通過(guò)表型篩選呈陽(yáng)性的物質(zhì)識(shí)別細(xì)胞內(nèi)的靶點(diǎn)，目前已經(jīng)有多種成熟的技術(shù)方法用于靶點(diǎn)的識(shí)別，也不斷有新的方法被廣大研究人員發(fā)現(xiàn)，并取得了較好的效果，隨著各項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，這些方法也在不斷完善中，相信在不久的將來(lái)會(huì)有一套完整的靶點(diǎn)識(shí)別方法。

靶點(diǎn)識(shí)別得到的候選靶點(diǎn)并不一定就是目標(biāo)靶點(diǎn)，其中可能混有假陽(yáng)性結(jié)果，靶點(diǎn)驗(yàn)證就是對(duì)候選靶點(diǎn)的進(jìn)一步篩選過(guò)程，并最終得到藥物-靶點(diǎn)結(jié)合復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)對(duì)后期的藥物優(yōu)化工作具有很大的幫助。

藥物靶點(diǎn)研究將對(duì)藥物的發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)具有極其重要的促進(jìn)作用，人們對(duì)藥物靶點(diǎn)的研究將長(zhǎng)期進(jìn)行。隨著對(duì)藥物靶點(diǎn)認(rèn)識(shí)的不斷提高，技術(shù)方法不斷成熟，新的藥物靶點(diǎn)將不斷發(fā)現(xiàn)，具有新型作用靶點(diǎn)、治療疾病效果更好的藥物也將不斷出現(xiàn)。

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