犬肺靜脈的組織學(xué)與HCN通道的表達(dá)研究

胡明艷，陳尚超，陳曼華

（1.湖北省武漢市中心醫(yī)院心內(nèi)科 430014；2.湖北省武鋼二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 430085）

近年來，許多研究證實(shí)來源于肺靜脈的快速局灶性沖動(dòng)在心房顫動(dòng)（以下簡(jiǎn)稱房顫）的誘發(fā)及維持上起著重要的作用［1－2］。超搏電流（funny current，If）離子流是心臟起搏電流的重要組成部分，其活動(dòng)增加，會(huì)導(dǎo)致自律性增加，容易引起快速心律失常。亞單位超極化激活的環(huán)核苷酸門控通道（hyperpolarization－activated cyclic nucleotide－gated cation channel，HCN）是可以產(chǎn)生類似心臟If或神經(jīng)元Ih電流的一類通道基因家族，每一亞單位形成的離子通道均具有內(nèi)在If的主要特征［3－4］，肺靜脈存在自發(fā)活動(dòng)，就很可能有該通道的存在。本實(shí)驗(yàn)觀察了犬肺靜脈肌袖的基本組織結(jié)構(gòu)，采用組織化學(xué)染色及分子生物學(xué)技術(shù)，從多個(gè)角度證實(shí)肺靜脈中有傳導(dǎo)細(xì)胞的存在，并探討犬快速心房起搏后急性房顫時(shí)HCN的變化，為揭示肺靜脈引發(fā)房顫的機(jī)制提供客觀的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型建立及分組 14只健康成年犬，雌雄不限，體質(zhì)量10～20kg，7只快速心房起搏作房顫組，其余7只未經(jīng)快速心房起搏處理為對(duì)照組。3%戊巴比妥鈉30mg／kg靜脈麻醉，氣管插管，必要時(shí)呼吸機(jī)輔助呼吸。沿胸骨正中切口，逐層開胸，切開心包暴露心臟。用心臟電生理刺激儀（SEN－7103型，日本產(chǎn)）經(jīng)右心房電極給予600次／分、脈寬2ms、4倍閾值的高速心房起搏脈沖直至誘發(fā)房顫；動(dòng)態(tài)記錄犬肢體6導(dǎo)聯(lián)心電圖。一旦房顫自行終止則繼續(xù)心房起搏誘發(fā)房顫。維持高速心房起搏／房顫8h。7只犬均誘發(fā)出房顫。處死動(dòng)物，留取部分肺靜脈及左心房組織，置入液氮速凍后，－80℃存放。

1.2 蘇木素－伊紅（HE）及高碘酸－希夫反應(yīng)（PAS）染色 將對(duì)照組犬麻醉后迅速開胸，剪取左心房與肺靜脈交接處向上延伸約1cm的肺靜脈肌袖組織，剪去肺靜脈肌袖內(nèi)外膜，將組織塊固定于10%中性甲醛溶液中24h后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，沿血管走行作縱向連續(xù)切片，厚5μm，每隔5張取1張做HE染色，其間隔的5張做PAS染色。

表1 引物序列與反應(yīng)條件

1.3 逆轉(zhuǎn)錄－PCR（RT－PCR）測(cè)兩組犬肺靜脈及左心房心肌HCN1、2、4的mRNA表達(dá) 取100mg冷凍組織，用Trizol試劑一步法提取肺靜脈及左心房心肌細(xì)胞的總RNA。在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定總RNA的濃度及純度，采用TaKaRa一步法RT－PCR試劑盒（購至大連寶生物工程有限公司），進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR?？偡磻?yīng)體系為25μL，分別依次加入總RNA1μL（≤1μg），10×緩沖液2.5μL，dNTP2.5μL，MgCl2（25mmol／L）5μL，RNA 酶抑制劑（40μ／μL）0.5μL，AVM 逆轉(zhuǎn)錄酶（5μ／μL）0.5μL，Taq酶（5μ／μL）0.5μL，上下游特異性引物（由上海生物工程有限公司合成）各0.5μL，加無RNA酶水至25μL。50℃30min逆轉(zhuǎn)錄，94℃2min預(yù)變性，開始循環(huán)：94℃變性30s，退火（溫度見表1）30s，40個(gè)循環(huán)后延伸于72℃，45s；最后4℃保存10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對(duì)電泳條帶進(jìn)行灰度計(jì)算，以βactin為參照，求出其相對(duì)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料用表示，不同組間的參數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色檢測(cè)肺靜脈纖維的走行方向 肺靜脈肌袖組織分為內(nèi)膜層、中層和外膜層，中層較厚，心肌細(xì)胞集合成束，呈縱行、環(huán)形和斜行排列。肺靜脈、尤其是肺靜脈左心房交界處肌纖維的排列方向復(fù)雜，走向紊亂（圖1A、B）。

2.2 PAS染色觀察傳導(dǎo)細(xì)胞 肺靜脈肌袖的心內(nèi)膜面可見大量PAS染色陽性的細(xì)胞（即傳導(dǎo)細(xì)胞）。左心房與肺靜脈交界處也可見PAS染色陽性的細(xì)胞，這些細(xì)胞的胞漿染色較淡，且一般比周圍PAS染色陰性的細(xì)胞大（圖2A～C）。

圖2 PAS染色觀察傳導(dǎo)細(xì)胞

2.3 RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果 以100bp DNA Ladder的分子標(biāo)記物為標(biāo)志，兩組犬的肺靜脈與左心房組織中分別于393、313、392bp處可見擴(kuò)增產(chǎn)物，320bp處無擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳帶的位置分別與 HCN2、HCN4、β－actin理論值相符（圖3～6）。

2.4 兩組犬肺靜脈及左心房中HCN1、2、4mRNA表達(dá)變化兩組犬肺靜脈的HCN4mRNA表達(dá)水平均明顯高于左心房（P＜0.05），房顫組肺靜脈與左心房的 HCN2、HCN4mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組均明顯升高（P＜0.05），且房顫組肺靜脈中HCN2的mRNA表達(dá)水平明顯高于房顫組左心房，但對(duì)照組肺靜脈與左心房的HCN2mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

圖3 對(duì)照組肺靜脈各目的基因及內(nèi)參的RT－PCR電泳圖

圖4 對(duì)照組左心房心肌各目的基因及內(nèi)參的RT－PCR電泳圖

圖5 房顫組肺靜脈各目的基因及內(nèi)參的RT－PCR電泳圖

圖6 房顫組左心房心肌各目的基因及內(nèi)參的RT－PCR電泳圖

表2 兩組犬肺靜脈與左心房心肌HCN1、HCN2、HCN4mRNA表達(dá)的比較（，n＝7）

表2 兩組犬肺靜脈與左心房心肌HCN1、HCN2、HCN4mRNA表達(dá)的比較（，n＝7）

－：未測(cè)到mRNA表達(dá)量；a：P＜0.05，與同組左心房比較；b：P＜0.05，與對(duì)照組相同部位比較。

組別 部位HCN1 HCN2 HCN4對(duì)照組 左心房 － 0.646±0.082 1.066±0.404肺靜脈 － 0.562±0.081 1.567±0.042a房顫組 左心房 － 0.850±0.107b 1.795±0.032b肺靜脈 － 1.230±0.088ab 2.113±0.151ab

3 討 論

肺靜脈的解剖結(jié)構(gòu)與陣發(fā)性房顫的關(guān)系密切，既往有研究發(fā)現(xiàn)肺靜脈中存在由左心房延伸到肺靜脈的心肌袖，并且具有電活動(dòng)［5－6］。本研究采用HE染色觀察到犬肺靜脈肌袖心肌纖維呈各種方向排列，但多數(shù)呈交錯(cuò)纏繞的非均一性排列，心肌纖維集合成束，呈環(huán)形、縱形和斜形排列。有學(xué)者認(rèn)為肺靜脈肌袖的心肌細(xì)胞排列混亂，可能是導(dǎo)致該部位電活性不均一的基礎(chǔ)，進(jìn)而易于誘發(fā)折返［7］，導(dǎo)致房顫的發(fā)生。

起搏細(xì)胞是心臟產(chǎn)生起搏的基礎(chǔ)，有研究發(fā)現(xiàn)，在傳導(dǎo)組織以外的不同部位還散在、無規(guī)律地分布著單個(gè)P細(xì)胞或P細(xì)胞團(tuán)［8－9］。大量動(dòng)物研究已證實(shí)［10－11］，肺靜脈肌袖組織中存在單個(gè)或聚集分布的P樣細(xì)胞，神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制可以調(diào)節(jié)其電活動(dòng)，使其易于產(chǎn)生自律性增高的電活動(dòng)，成為異位興奮灶，導(dǎo)致局灶性房顫的發(fā)生。當(dāng)竇房結(jié)和心房的功能正常時(shí)，P樣細(xì)胞的起搏功能被心臟正常節(jié)律所抑制。當(dāng)機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌等因素發(fā)生變化時(shí)，肺靜脈肌袖組織中的P樣細(xì)胞以觸發(fā)或驅(qū)動(dòng)機(jī)制導(dǎo)致房顫的發(fā)生。而肺靜脈肌袖肌纖維的環(huán)形、斜行和縱行分布，使P樣細(xì)胞產(chǎn)生的激動(dòng)在肺靜脈內(nèi)傳導(dǎo)方向和速度不同，產(chǎn)生傳導(dǎo)延遲或阻滯，為微折返環(huán)形成創(chuàng)造條件，這些因素均可協(xié)同促進(jìn)房顫的發(fā)生與維持。PAS染色常用于檢測(cè)蒲肯野纖維及其他心肌傳導(dǎo)細(xì)胞中的糖原［12］，本實(shí)驗(yàn)就采用此方法在肺靜脈中發(fā)現(xiàn)了染色陽性的細(xì)胞，初步說明肺靜脈中有傳導(dǎo)細(xì)胞的存在。這些細(xì)胞可以產(chǎn)生自律性的電活動(dòng)，從而構(gòu)成了肺靜脈源性房顫的組織細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

HCN通道有4種亞型，在哺乳動(dòng)物心臟中目前發(fā)現(xiàn)只有HCN1、HCN2及 HCN43種亞型表達(dá)［3］，它們所產(chǎn)生的電流均具有典型的If電流特征，然而其在肺靜脈的表達(dá)及該電流在房顫中所起的作用還不是很清楚。本實(shí)驗(yàn)對(duì)犬肺靜脈中HCN通道的mRAN表達(dá)水平進(jìn)行了研究，證實(shí)了肺靜脈中有該通道的存在。HCN4是產(chǎn)生起搏電流的主要離子通道，與傳導(dǎo)組織的自律性細(xì)胞密切相關(guān)［13］，是正常起搏電流產(chǎn)生的重要因素，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是一致的，兩組的肺靜脈與左心房中都是以HCN4為主，肺靜脈更高，這可能也是其If電流增高的原因之一。以往的研究表明在病理情況下If的表達(dá)是增加的。If通道m(xù)RNA在充血性心力衰竭左心房充盈壓升高時(shí)表達(dá)增加，而房顫患者升高更明顯，提示房顫的發(fā)生可能與If過度活動(dòng)有關(guān)［14］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)房顫組肺靜脈與左心房的HCN4、HCN2的mRNA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，并且兩組肺靜脈中HCN4的mRNA表達(dá)均明顯高于左心房，這種差異性可能是其離子流差異的分子基礎(chǔ)，從而導(dǎo)致復(fù)極異質(zhì)性，利與房顫的發(fā)生。

HCN2通道主要與非自律性的心肌相關(guān)，并與舒張期膜電位的維持有關(guān)［15］，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組肺靜脈與左心房組織中HCN2的濃度無明顯差異，說明其在肺靜脈心肌自發(fā)活動(dòng)中可能不起關(guān)鍵作用。肺靜脈肌袖能夠產(chǎn)生舒張期自動(dòng)除極可能并不是由單一的If電流引起，而是由于多種離子流綜合作用形成的微弱內(nèi)向離子流所致。但房顫組肺靜脈與左心房HCN2有明顯差異，這說明肺靜脈的潛在起搏活性，病理狀態(tài)時(shí)HCN2可能起著重要作用。當(dāng)然這與取材部位的不同可能也有一定關(guān)系。HCN1通道并非心室肌和心房肌組織的主要通道亞型，其濃度很少，本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及房顫組肺靜脈與左心房組織中均無HCN1的mRNA表達(dá)，這也可能是其表達(dá)量很少，本實(shí)驗(yàn)未能檢測(cè)出。從此可以推斷，房顫患者心房電重構(gòu)或If增高可能不是源于HCN1轉(zhuǎn)錄水平的異常。本研究發(fā)現(xiàn)HCN通道在房顫的發(fā)生機(jī)制中可能起著重要的作用，從而為房顫的臨床藥物治療提供了新靶點(diǎn)。

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