不同凍存液凍存慢病毒轉(zhuǎn)染后穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞株HepG2的效果比較＊

李 佳，陸會平，馮振博，莫偉嘉

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，南寧 530021）

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，經(jīng)常需要凍存一部分細(xì)胞，避免培養(yǎng)細(xì)胞表型的改變而導(dǎo)致重復(fù)實驗條件不一的狀況，并為進一步的實驗保存狀態(tài)良好的細(xì)胞。細(xì)胞一般采用液氮低溫保存，凍存及復(fù)蘇時必須遵循“慢凍快融”的原則。本課題組在凍存慢病毒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞時，嘗試了多種不同配方的細(xì)胞凍存液，最后篩選出一種理想的可用于液氮保存慢病毒轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞的凍存液。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 細(xì)胞株HepG2細(xì)胞及其慢病毒轉(zhuǎn)染后穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株為本實驗室保存。完全DMEM培養(yǎng)基由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供，胎牛血清（FBS）由杭州四季青提供，胰酶由碧云天生物技術(shù)研究所提供，甘油和二甲基亞砜（DMSO）由北京索萊寶科技有限公司提供。－20℃冰箱由海爾電器公司提供，－80℃超低溫冰箱由日本三洋公司提供，普通高速離心機由德國Eppendorf公司提供，酶標(biāo)儀 Model－450由美國Bio－Rad公司提供，液氮罐為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 凍存方法 常規(guī)胰酶消化細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，1000r／min離心1min后棄去上清液，分組加入以下凍存液：分別采用甘油和DMSO為保護劑，按以下配方各配備4種比例凍存液。（1）A液，DMEM∶FBS∶保護劑＝7∶2∶1；（2）B液，DMEM∶FBS∶保護劑＝6∶3∶1；（3）C液，DMEM∶FBS∶保護劑＝5∶4∶1；（4）D液，DMEM∶FBS∶保護劑＝0∶9∶1。然后輕輕混勻，凍存前統(tǒng)一調(diào)整細(xì)胞密度到1×106個／毫升，將細(xì)胞懸液移至凍存管，每管1.5mL，梯度降溫凍存，將凍存管置于4℃冰箱30min，－20℃60～120min后轉(zhuǎn)移至－80℃過夜（16h），轉(zhuǎn)至液氮保存。

1.2.2 細(xì)胞的復(fù)蘇 從液氮中取出凍存管，迅速置于40℃水浴箱中快速搖動，使其迅速融化后，將細(xì)胞懸液加入已放置4 mL含10%FBS的完全DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，輕輕混勻后置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.3 倒置相差顯微鏡下觀察 復(fù)蘇細(xì)胞6～8h后換液，在倒置相差顯微鏡下觀察復(fù)蘇后細(xì)胞的存活情況，按已貼壁細(xì)胞即為存活細(xì)胞，未貼壁細(xì)胞為死亡細(xì)胞的原則，觀察復(fù)蘇后細(xì)胞的存活率。

1.2.4 MTT法 將各組細(xì)胞接種于96孔板，2×103個／孔，每組細(xì)胞均做5個復(fù)孔，分別于種板后24、48、72、96h加入20μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸盡培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，振蕩10min后上酶標(biāo)儀檢測490nm處吸光度值，繪制生長曲線。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用表示，組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 倒置相差顯微鏡下觀察的細(xì)胞存活率 采用甘油作為凍存保護劑時，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞存活，且凍存液比例為0∶9∶1（DMEM∶FBS∶甘油）時，細(xì)胞存活率明顯高于其他3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝14.811，P＝0.001）；未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的存活率均達到60%及以上，不同比例的凍存液組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F＝1.473，P＝0.293）。采用DMSO作為凍存保護劑時，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞存活率為0%，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的存活率均達到60%及以上，不同比例的凍存液組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F＝0.890，P＝0.487）。見表1。

表1 倒置相差顯微鏡下觀察的細(xì)胞復(fù)蘇后的存活率

2.2 MTT法檢測凍存細(xì)胞復(fù)蘇后的生長情況 兩組細(xì)胞在不同比例凍存液凍存復(fù)蘇后的生長情況見圖1。圖中結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞以甘油作為凍存保護劑細(xì)胞存活（圖1A），且凍存液中血清含量越高，復(fù)蘇后細(xì)胞的增殖能力越強（P＜0.05）；而用DMSO作為凍存保護劑凍存的轉(zhuǎn)染細(xì)胞復(fù)蘇后成活率幾近于0%（圖1B）。無論是以DMSO還是以甘油作為凍存保護劑，HepG2細(xì)胞復(fù)蘇后都能存活，且復(fù)蘇后均具有較好的增殖能力（圖1C，圖1D）。

圖1 各組細(xì)胞復(fù)蘇后生長曲線圖

3 討 論

目前認(rèn)為細(xì)胞處在對數(shù)生長期時最適合凍存，而細(xì)胞凍存需要遵循“慢凍”的原則［1］。除此之外，凍存液的成分及其比例對細(xì)胞凍存、復(fù)蘇效果也起著很重要的作用，其中凍存保護劑和血清是在細(xì)胞凍存過程中最為重要的兩個因素。

Wastts等［2］認(rèn)為凍存細(xì)胞時一定要加入保護劑。如果直接凍存，細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶會導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白質(zhì)、酶變性，溶酶體膜損傷，細(xì)胞核內(nèi)DNA受損［3］，從而引起細(xì)胞死亡。因此，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成是減少細(xì)胞損傷的關(guān)鍵［4］。凍存保護劑除了可以減少降溫過程中胞內(nèi)外冰晶的形成，還可降低“溶質(zhì)效應(yīng)”。目前最常用的凍存保護劑有DMSO、甘油、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等。其中，DMSO相對分子質(zhì)量小、滲透性強，通過降低凍存液冰點和細(xì)胞內(nèi)外的電解質(zhì)濃度，改變細(xì)胞膜的通透性，保護細(xì)胞免受冷凍損傷［5－6］。Chesne等［7］報道，DMSO與甘油等凍存保護劑相比較，具有更好的保護作用。但DMSO具有一定的細(xì)胞毒性［8］，高濃度不利于細(xì)胞的冷凍保護。Diener等［9］認(rèn)為10%DMSO 為最佳凍存劑濃度［9］。然而，于麗敏［10］報道，對耐藥的腫瘤細(xì)胞株進行凍存時，使用10%～15%的甘油（占凍存液百分比）作為保護劑，細(xì)胞存活率明顯高于用DMSO作為保護劑的，此結(jié)果與本實驗結(jié)果相同。是否在腫瘤細(xì)胞受到外界損傷后（藥物刺激、慢病毒感染等），細(xì)胞對DMSO敏感性提高，無法抵御其細(xì)胞毒性，進而影響復(fù)蘇效果，這其中的機制仍有待研究。

FBS中含有豐富的細(xì)胞生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，是細(xì)胞培養(yǎng)中最天然的培養(yǎng)基［11］。若含DMSO的凍存液中血清濃度低則細(xì)胞復(fù)蘇后活力低，原因可能是FBS可以中和DMSO的毒性，以及血清中的纖維粘連素有助于細(xì)胞貼壁［12－13］。本實驗結(jié)果也表明血清濃度對復(fù)蘇后細(xì)胞的活力有一定的影響，凍存液中血清含量越高，復(fù)蘇后細(xì)胞的增殖能力越強。

總而言之，細(xì)胞凍存對實驗的順利進展至關(guān)重要。由本實驗結(jié)果可知，凍存慢病毒轉(zhuǎn)染后穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞株HepG2的最佳凍存液為90%FBS＋10%甘油。望本研究結(jié)果能給其他課題組的細(xì)胞凍存提供一種借鑒的方法。

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