間充質(zhì)干細胞干性維持信號通路的研究進展

周 穎，高孟飛，朱慧勇

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科，浙江 杭州 310003；2.浙江省慈溪市人民醫(yī)院口腔科，浙江 慈溪 315300）

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）是具有多向分化潛能的干細胞，能夠誘導(dǎo)分化為多種組織，包括骨、軟骨、脂肪、肌肉和肌腱等［1］。Owen和Friedenstein［2］最先報道從骨髓中分離得到一種能夠分化為多種組織的類纖維細胞——MSC［2］。骨髓是MSC的常見來源，其他來源還包括脂肪、軟骨、肌肉、羊水、肝臟、胎盤、臍血和牙髓等［3－4］。國際細胞治療協(xié)會提供了以下的最低標準用于定義人類MSC［5］：①標準培養(yǎng)條件下的塑料貼壁細胞；②表面標志物CD105、CD73和CD90表達陽性，而缺乏CD34、CD45、CD11a、CD19和HLA－DR等造血干細胞的表面標志物的表達；③特定的刺激下，細胞在體外可分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞。MSC干性即多能性，即MSC能夠多向分化的能力［6］。MSC干性的維持依賴于細胞的自我更新，即在MSC非分化性增殖的同時抑制細胞的凋亡并保持其多向分化的潛能［7］。MSC的可獲得性、可擴張性和可分化性使其在臨床治療和組織工程中具有廣泛的應(yīng)用前景［3］。而MSC的有效應(yīng)用有賴于了解并認識維持干性的信號通路分子機制。

1 MSC的應(yīng)用前景

MSC的多向分化潛能和免疫抑制的特性使其在臨床上具有良好的應(yīng)用前景。已有大量研究［4－8］報道了 MSC在組織修復(fù)和再生方面的應(yīng)用。通過擴增培養(yǎng)，MSC可以遷移到受傷的組織并調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，通過協(xié)同下調(diào)炎性細胞因子和促生長因子及上調(diào)抗炎因子，從而有利于組織修復(fù)。在再生醫(yī)學(xué)方面，MSC在一定誘導(dǎo)條件作用下可以定向分化為中胚層和內(nèi)、外胚層組織細胞，許多組織工程產(chǎn)品，如人造皮膚、血管、骨、軟骨、肌肉、瓣膜、神經(jīng)、胰島、腎臟和肝臟等組織器官或細胞將相繼問世，被植入患者體內(nèi)，用以恢復(fù)損傷、替代退行性組織器官以及改變遺傳缺陷性組織器官的功能［8－10］。此外，MSC具有顯著的免疫抑制特性，能夠抑制T細胞、NK細胞的功能，并調(diào)節(jié)樹突狀細胞的活動［8］。基于其免疫抑制特性，MSC被用于在移植物抗宿主病和自身免疫病的治療［11－12］。

2 MSC的干性基因

應(yīng)用全球基因表達分析，Song等［6］通過對比3種間充質(zhì)譜系（成骨、成軟骨和成脂肪）的未分化、分化和轉(zhuǎn)分化的細胞，鑒定出一系列與維持MSC的多能性密切相關(guān)的干性相關(guān)基因。小干擾RNA基因失活研究［6］表明：肌動蛋白絲相關(guān)蛋白（actin filament－associated protein，AFAP）、frizzled 7（FZD7）、dickkopf 3（DKK3）、蛋白酪氨酸磷酸酶受體F（protein tyrosine phosphatase receptor F，PTPRF）和RAB3B5種基因能促進細胞存活并對骨髓MSC的分化有不同的影響［6］。有研究［13－15］還報道：一些胚胎干細胞標記物，如Oct－4、SOX－2、Rex－1和 Nanog與 MSC的自我更新有關(guān)聯(lián)。Liu等［13］研究發(fā)現(xiàn)：Nanog和Oct4在 MSC中的過表達能夠促進細胞的增殖并增強MSC集落形成，表明Nanog和Oct4的過表達與 MSC的干性維持有關(guān)聯(lián)。Roche等［16］通過特定的培養(yǎng)基在體外培養(yǎng) MSC發(fā)現(xiàn)：MSC中的Oct－4、Rex－1和Gata－4表達增高，認為這種表達增高可能與 MSC向成骨、成軟骨分化的效率增高有關(guān)聯(lián)。Bmi－1（B cellspecific MLV intergration site－1）基因是polycom（PcG）家族成員之一，對于維持發(fā)育過程中的基因表達模式，維持體細胞和肝細胞的正常生命活動均具有重要調(diào)節(jié)作用［17］。有研究［17－18］指出：Bmi－1基因可能是影響 MSC增殖能力的一個重要基因，包括骨髓MSC和臍血MSC。王芳等［19］認為：Bmi－1基因正性調(diào)控人類胚胎骨髓來源MSC的增生，并防止衰老，當(dāng)細胞內(nèi)Bmi－1的轉(zhuǎn)錄水平下降時，細胞增生減慢，衰老細胞數(shù)量顯著增加。

3 MSC干性維持的信號通路機制

3.1 Wnt信號通路 Wnt信號在維持MSC的自我更新及其分化方面具有重要作用［20］。Wnts是高度保守的，富含半胱氨酸的分泌配體，到目前為止，已確定存在人類中的有19個。Wnt信號能夠激發(fā)至少4種不同的信號通路，最具特色是其經(jīng)典通路，該通路通過調(diào)節(jié)β－鏈蛋白（β－catenin）的穩(wěn)定，導(dǎo)致下游靶基因的轉(zhuǎn)錄［20］（圖1）。當(dāng)在無 Wnt配體的情況下，β－catenin在糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase－3β，GSK－3β）、軸蛋白（Axin）和腺瘤性息肉蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）協(xié)同作用下，被GSK－3β磷酸化，使β－catenin泛素化后通過蛋白酶體降解。但當(dāng)Wnt配體與Frizzled（Fz）受體和脂蛋白受體相關(guān)蛋白（lipoprotein receptor－related protein，LRP）輔助受體（LRP5／6）結(jié)合時，激活了胞質(zhì)蛋白（disheveled，DVL），抑制了GSK－3β對β－catenin的磷?；饔?，使β－catenin穩(wěn)定并累積增加，轉(zhuǎn)運入細胞核中與T細胞因子和淋巴增強因子（TCF／LEF）結(jié)合，以調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄［20］。

圖1 經(jīng)典Wnt信號通路Fig.1 The classic Wnt signaling pathway

Wnt信號通路可以通過多種方式被抑制。Dikkopf－1（DKK－1）是一種 Wnt抑制劑，其通過與LRP5／6受體形成絡(luò)合物，從而促進受體的降解［20－21］；分泌型卷曲相關(guān)蛋白（secreted frizzled－related protein，sFRPs）與 FZ 競爭 Wnt信號配體的結(jié)合，阻止其與受體的相互作用抑制Wnt信號［22－23］；pyrvinium為強效 Wnt信號抑制劑，其能通過減少細胞質(zhì)β－catenin，抑制其成骨和成軟骨，促進MSC在體外的增殖［24］。然而，基于多種因素的影響，Wnt信號通道對MSC自我更新的作用也眾說紛紜。Boland等［25］認為：經(jīng)典的Wnt信號通路能夠維持MSC的非分化性增殖，而非經(jīng)典的Wnt信號通道能夠促進MSC的成骨。但Qiu等［26］發(fā)現(xiàn)：在旁分泌或自分泌的方式下，經(jīng)典 Wnt信號抑制人類骨髓MSC的增殖。De等［27］認為：低水平 Wnt信號通路能促進MSC增殖，但高水平Wnt信號有相反的影響，并導(dǎo)致MSC生長停滯。

3.2 骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號通路 BMP是干細胞的重要調(diào)控者［28－29］，BMP作為一種多功能細胞因子，被鑒定為轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor－β，TGF－β）超家族的成員［30］。BMP受體（BMPR）有2種亞型，分別為BMPR－Ⅰ和BMPR－Ⅱ，均為絲氨酸－蘇氨酸激酶受體。當(dāng) BMP與BMPR－Ⅱ結(jié)合時，BMPR－Ⅰ形成活化的四元復(fù)合物，然后磷酸化激活細胞內(nèi)的Smad蛋白，Smad受體與co－SMAD蛋白結(jié)合并轉(zhuǎn)位到細胞核中，充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子，與轉(zhuǎn)錄共活化劑或抑制劑作用以調(diào)節(jié)基因表達［1，7，29－30］。

Kolf等［14］認為：在分子水平上，BMP與調(diào)節(jié)干細胞的分化過程相關(guān)。BMP信號通路通過BMP配體誘導(dǎo)或抑制MSC成骨的分化，也能誘導(dǎo)MSC成軟骨。Liu等［31］認為：BMP－2能通過特定BMP的R－Smad蛋白與Dishevelled－1的相互作用以拮抗Wnt3a的信號從而抑制小鼠骨髓來源的MSC增殖，可能通過抑制BMP信號通道，提高MSC的自我更新。雖然尚無大量的實驗數(shù)據(jù)證實BMP信號在MSC自我更新方面的作用，但有研究［28］表明BMP有利于小鼠和人胚胎干細胞的自我更新。也有研究［7］顯示：一種 Wnt信號抑制劑即分泌型卷曲相關(guān)蛋白2（secreted frizzledrelated protein 2，sRP2）可以通過抑制 Wnt和BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，降低MSC凋亡并抑制MSC成骨和成軟骨分化，增加干細胞的自我更新和存活。

3.3 Notch信號通路

Notch信號通路是另一個參與調(diào)節(jié)細胞命運的重要的途徑［32］。Notch本身是一種跨膜受體，當(dāng)Notch在相鄰細胞表面上與膜結(jié)合配體Delta或Jagged作用，Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（Notch intracellular domain，NICD）通過g－分泌從膜上被蛋白水解裂解，然后NICD轉(zhuǎn)位到細胞核中，配合并激活轉(zhuǎn)錄因子CSL。CSL招募共激活因子 Mastermind－like（MAML）等，并啟動轉(zhuǎn)錄的靶基因［1，32］。Notch的蛋白水解裂解是一個多步驟的過程，涉及γ－分泌酶復(fù)合物素－1和γ－分泌酶復(fù)合物素－2［32］。

有研究［32］表明：Notch在MSC分化世系中發(fā)揮重要作用，在小鼠軟骨細胞和成骨細胞的細胞系中，高表達Notch配體（Delta－1）或NICD抑制了成骨細胞和軟骨細胞的分化，而Notch信號通路在脂肪細胞形成中的作用尤為復(fù)雜。微陣列基因表達分析研究顯示：在人MSC分化過程中，與Notch信號通路相關(guān)的基因表達量會隨著分化的進行而改變。Westwood等［32］研究了Notch信號在調(diào)節(jié)MSC增殖和分化中的作用，結(jié)果顯示：在增殖的MSC中添加DAPT，能降低MSC的增殖能力并改變其分化潛能。DAPT是一個特定的γ－分泌酶抑制劑，能在體外抑制軟骨形成，但能誘導(dǎo)MSC向脂肪細胞的分化。也有學(xué)者［1］認為：Notch信號可能會促進成骨分化，但不一定促進骨形成。在NICD過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠中，Notch成骨細胞特異性功能的增加會導(dǎo)致骨質(zhì)異常密集或硬化骨，而通過突變γ－分泌使Notch信號缺失會導(dǎo)致遲發(fā)性、與年齡有關(guān)的骨質(zhì)疏松癥［1］。這些相互矛盾結(jié)果的出現(xiàn)可能是由于調(diào)節(jié)成骨細胞分化的時間點不同或特定劑量的Notch激活和（或）其與Wnt和BMP信號通路的交互影響。因此Notch信號有可能通過影響MSC的分化而調(diào)節(jié)MSC自我更新。

3.4 成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）對MSC干性的調(diào)節(jié) FGF是普遍應(yīng)用于促進干細胞增殖的生長因子，包括人胚胎干細胞、MSC以及其他特定組織的干細胞［33－34］。在 MSC培養(yǎng)過程中添加FGF能夠增加MSC的增殖速度和壽命，同時不改變其分化的潛能［34］。FGF信號在MSC的增殖和分化中起著至關(guān)重要的作用，在小鼠骨髓MSC中，F(xiàn)GF－2已被證實為一種強效有絲分裂原［35］。Ng等［3］采用轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)：TGF－β、血小板源性生長因子（platelet－derived growth factor，PDGF）和FGF介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在MSC增殖中發(fā)揮重要作用。抑制上述任何信號均能降低MSC生長，而這3個因素的組合，能使MSC在體外培養(yǎng)傳代至5代以上，表明這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對MSC生長有重要作用。

FGF家族由22個顯現(xiàn)為高度同源性的配體組成，有4個已知的 FGF受體［33－35］。有研究［33］顯示：FGF受體發(fā)起的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是通過FRS2控制中心激活Ras2α／ERK信號通路，F(xiàn)GF－ERK軸能通過多種模式控制干細胞的干性。Coutu等［35］認為：FGF－2能夠通過 PI3K／AKTMDM2通路抑制細胞衰老并促進其增殖以維持MSC干性。MDM2在Ser186細胞中被AKT／PI3磷酸化，導(dǎo)致MDM2的核轉(zhuǎn)位。在細胞核中，pMDM2增加針對p53基因的泛素連接酶活性，使后者被蛋白酶體降解，從而抑制細胞衰老。因此，F(xiàn)GF－2能夠保護MSC免于增殖誘導(dǎo)的細胞衰老并無限增殖，F(xiàn)GF－2在MSC的自我更新和干性的維持方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用［35］。

3.5 Hedgehog（Hh）信號通路 Hh信號通路對胚胎干細胞的分化和生長發(fā)育早期的骨骼形成有重要作用，已有研究［1］報道：Hh通過Runx2誘導(dǎo)成骨，且能聯(lián)合BMP－2對MSC成骨產(chǎn)生協(xié)同作用。Plaisant等［36］研究發(fā)現(xiàn)：骨髓MSC分化后導(dǎo)致Hh信號下降，刺激Hh信號并未對人MSC的增殖產(chǎn)生影響，而抑制Hh信號能夠降低人MSC的增殖和克隆形成（自我更新的一個指標），闡明了Hh與MSC的增殖、自我更新和分化有關(guān)聯(lián)。

當(dāng)Hh結(jié)合到其受體Patched（Ptc）時，就啟動了Hh信號。一經(jīng)結(jié)合，Ptc解除了其對跨膜蛋白Smoothened（Smo）的抑制作用。然后Smo進入細胞的初級纖毛（對Hh信號有關(guān)鍵作用的細胞器），激活細胞內(nèi)的級聯(lián)而使轉(zhuǎn)錄因子Gli2穩(wěn)定，Gli2進入細胞核誘導(dǎo)Hh目標基因的轉(zhuǎn)錄，例如Gli1（一個Hh信號標志）。Gli2是Hh信號的一個關(guān)鍵組分，Gli2的失活能抑制Hh信號通路［1，36］。

3.6 TGF－β信號通道 TGF－β及其家族成員，包括BMP、Nodal和激動素被廣泛應(yīng)用于各種器官的生長和維持，而干細胞在其中起著重要作用。TGF－β家族信號對胚胎干細胞干性的維持和自我更新具有重要作用。已有研究［29］報道：TGF－β1能誘導(dǎo)hMSC增殖。TGF－β1能通過誘導(dǎo) MSC的Smad3－依賴核積聚β－連環(huán)素，而β－連環(huán)素是MSC增殖的刺激物。Ng等［3］通過轉(zhuǎn)錄組分析提出：TGF－β、PDGF和FGF信號通路對MSC增殖有重要作用。這些信號通路的任一信號的抑制均能降低MSC增殖，而3種因子的結(jié)合能使MSC多代傳代，提示這些信號通路對MSC的生長有重要作用。

3.7 磷酸酰肌醇－3－激酶（phosphatidylinositol－3－kinase，PI3K）信號通路 PI3K是1個包括許多脂質(zhì)激酶的家族，由1個調(diào)節(jié)亞基（P85）和1個催化亞基（P110）組成。當(dāng)相應(yīng)的配體和膜受體結(jié)合后，激活P85募集P110在細胞膜附近使其活化，進而催化膜內(nèi)表面的磷酸激醇二磷酸（PIP2）生成磷酸激醇三磷酸（PI3P）。PI3P作為第二信使，激活A(yù)KT（PI3K的重要下游分子）和磷脂酰肌醇依賴性激酶1（phosphoinositide－dependent kinase 1，PDK1）。AKT是PI3K重要的下游分子，對于調(diào)控細胞的大小、生長、增殖、存活和糖代謝均有重要作用。當(dāng)AKT激活后，磷酸化結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物2（TSC2），從而解除TSC1／2對Rheb的抑制，由Rheb活化雷帕霉素靶蛋白（target of rapamycin，mTOR）。mTOR激活下游靶蛋白，對細胞生長和代謝進行調(diào)控。第10號染色體丟失的磷酸酶（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）基因位于人染色體雜合體缺失高發(fā)區(qū)10q2313上，其可通過將PI3P去磷酸化為PIP2實現(xiàn)對PI3K負調(diào)節(jié)作用［37］。

近來研究［37－38］表明：PI3K通路對于維持胚胎干細胞存活、增殖和維持其分化發(fā)揮重要作用。對PI3K信號通路起負調(diào)控作用的PTEN缺失時，可導(dǎo)致MSC增殖速度明顯加快。除了對胚胎干細胞的增殖作用外，PI3K能促進細胞的自我更新能力以維持胚胎干細胞的未分化狀態(tài)。此外，有研究［37］顯示：通過應(yīng)用mTOR特異性阻斷劑rapamycin阻斷該通路在MSC中的活化，觀察到MSC的成骨分化明顯受到抑制，表明PI3K－AKT－mTOR信號通路的活化在MSC的成骨分化方面發(fā)揮重要作用。

綜上所述，MSC干性維持的內(nèi)在分子通路機制仍存在爭議，其結(jié)果也尚無定論。這些可變性可能源于多種原因，如MSC的來源、相互作用的配體或蛋白質(zhì)的量、特定的時序和各種信號通道之間的相互影響等。因此，MSC內(nèi)在的分子機制尚需進一步研究。

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