硝普鈉(SNP)和茉莉酸甲酯(MeJA)誘導(dǎo)的白樺Ty1－copia類逆轉(zhuǎn)座子的克隆及分析1)

梁楠松 曾凡鎖 李 博 郭 梁 詹亞光

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

逆轉(zhuǎn)座子(retrotransposons)廣泛分布在植物中，其種類繁多，是植物核基因組中重要的組成部分，它的增殖和轉(zhuǎn)座主要以RNA為中間產(chǎn)物(DNA→RNA→DNA)，反轉(zhuǎn)錄成 DNA，在插入到基因組中［1］，逆轉(zhuǎn)座子在植物基因組中有很高的拷貝性，對(duì)其序列的克隆與分析，以及對(duì)研究植物基因組組成、進(jìn)化、系統(tǒng)發(fā)育、生物多樣性以及表達(dá)調(diào)控都具有重要的意義。逆轉(zhuǎn)座子包括長(zhǎng)末端重復(fù)(long terminal repeat，LTR)和非長(zhǎng)末端重復(fù)(non－LTR)兩類，LTR 又可分為 Ty1－copia類和 Ty3－gypsy類［2］，其中 Ty1－copia類逆轉(zhuǎn)座子是目前所知道的數(shù)目最多、研究最深入的LTR類逆轉(zhuǎn)座子［3－4］。在植物逆轉(zhuǎn)座子中，多數(shù)的逆轉(zhuǎn)座子都是沒(méi)有活性的，而它們的活性受環(huán)境和發(fā)育過(guò)程的調(diào)節(jié)。生物逆境脅迫和誘導(dǎo)能夠激活特定的逆轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄［5－7］，例如用MeJA處理煙草葉片能夠誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)座子中Tnt1A的轉(zhuǎn)錄活性，2，4－二氯苯氧乙酸(2，4－D)或水楊酸處理會(huì)使Tnt1C誘導(dǎo)表達(dá)［8］，2，4－D 還能夠誘導(dǎo)蘋(píng)果愈傷組織中 Ty1－copia 類逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄活性［9］。Kimur Y 等［10］人研究發(fā)現(xiàn)傷害、紫外誘導(dǎo)、MeJA和水楊酸等誘導(dǎo)能使OARE－1逆轉(zhuǎn)座子劇烈表達(dá)，說(shuō)明OARE－1對(duì)非生物和生物脅迫都具有響應(yīng)。在植物、動(dòng)物和微生物中都能檢測(cè)到同一類的逆轉(zhuǎn)座子，并且這些逆轉(zhuǎn)座子具有較高的相似性，說(shuō)明逆轉(zhuǎn)座子不僅可以在世代中進(jìn)行縱向傳遞，而且還可以在物種間進(jìn)行橫向傳遞，逆轉(zhuǎn)座子在縱向和橫向傳遞過(guò)程中產(chǎn)生了高度異質(zhì)性，而它的水平傳遞成為了不同物種間聯(lián)系的橋梁。

白樺(Betula platyphylla Suk.)又稱樺木，是樺木科(Betulaceae)樺木屬(Betula Linn.)的一種。白樺是落葉喬木，樹(shù)皮白色、其扎根深，耐貧瘠，耐嚴(yán)寒，喜酸性土壤，適應(yīng)性強(qiáng)生長(zhǎng)快，材質(zhì)優(yōu)良，是重要的工業(yè)樹(shù)種。白樺樹(shù)皮中含有的豐富的次生代謝產(chǎn)物具有醫(yī)療保健美容等重要功能，具有重大的開(kāi)發(fā)價(jià)值。前人對(duì)誘導(dǎo)條件下提高白樺次生代謝產(chǎn)物的研究有很多報(bào)道但是對(duì)誘導(dǎo)脅迫下白樺逆轉(zhuǎn)座子克隆以及Tyl－copia類逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄活性的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)從白樺愈傷組織中分離克隆了Tyl－copia類逆轉(zhuǎn)座子部分逆轉(zhuǎn)錄酶序列，研究了誘導(dǎo)處理對(duì)Tyl－copia類逆轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄活性的響應(yīng)以及特性，為今后進(jìn)一步研究逆轉(zhuǎn)座子對(duì)白樺次生代謝產(chǎn)物積累的響應(yīng)等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

白樺(Betula platyphylla Suk.)材料取自東北林業(yè)大學(xué)白樺強(qiáng)化種子園，并通過(guò)誘導(dǎo)白樺莖段獲取愈傷組織。

材料處理:愈傷組織分別經(jīng)2 mmol·L－1SNP和1 mmol·L－1MeJA 處理 12 h。

1.1 RNA的提取以及逆轉(zhuǎn)錄酶的擴(kuò)增

RNA提取采用緩沖液冰浴CTAB法［11］，利用核酸蛋白分析儀，對(duì)提取的總RNA含量和質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。

RT－PCR:反轉(zhuǎn)錄用Oligo(dT)作下游引物合成cDNA第一條鏈，按照TaKaRa RNA PCR Kit操作指南進(jìn)行。

引物:利用CODEHOP方法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以RTpl和RTp2為引物擴(kuò)增Tyl組逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT基因片段。RTp1序列為 5’－CAGATGGACGTGAAGamngcnttyyt－3’，RTp2 序列為 5’－GATCATCATGtmrtcnryrta－3’，其中 m 代表 A 或 C，n代表 A或T或C或G，y代表C或T，r代表A或G。

反應(yīng)體系:20 μL反應(yīng)體系中10×PCR buffer 2 μL，2.5 mmol·L－1的 dNTP 2 μL，上下游引物各 20 pmol，rTaq 0.2 μL，cDNA/DNA 模板 2 μL，DEPC 水補(bǔ)足 20 μL。

擴(kuò)增:為了優(yōu)化反應(yīng)條件分別采用了兩種方法。①梯度 PCR，溫度梯度為 40、44.1、47.2、50.4、53 ℃。PCR程序?yàn)?94℃ 3 min;94℃ 30 s，退火45 s，72℃45 s，30個(gè)循環(huán);72℃ 7 min;4℃ 10 min。②采用兩次降落PCR，將第一次擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100倍后經(jīng)過(guò)同樣的程序再次擴(kuò)增富集PCR產(chǎn)物。程序?yàn)?94℃3 min;94℃ 30 s，53℃－0.8℃×n(n 為循環(huán)次數(shù))45 s，72 ℃ 45 s，10 個(gè)循環(huán);94 ℃ 30 s，45 ℃ 45 s，72 ℃45 s，20個(gè)循環(huán);72℃ 7 min;4℃ 10 min。

1.2 PCR產(chǎn)物的回收、克隆及純化

PCR產(chǎn)物采用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn)的UNIQ－10柱式DNA膠回收試劑盒回收，連接寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的pMD18－T Vector，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)12～16 h，藍(lán)白斑篩選挑取白色克隆浸到含100 mg·mL－1AmplB液體培養(yǎng)基中，37℃搖6～10 h后PCR檢測(cè)。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄酶序列測(cè)定及序列分析

采用雙脫氧核苷酸鏈終止法，委托上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。獲得的序列用blastx、blastn在 GenBank中進(jìn)行檢索分析，利用DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)，并利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果、重組質(zhì)粒的鑒定及測(cè)序

試驗(yàn)初始參照Kumar等人［12］的研究結(jié)果，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增結(jié)果不理想，后來(lái)利用CODEHOP(Consensus Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primers)來(lái)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增的結(jié)果較好，并且通過(guò)梯度PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果來(lái)看(如圖1)，不同退火溫度對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶序列的擴(kuò)增影響不大。但是在RT－PCR時(shí)，由于cDNA濃度太低，無(wú)法擴(kuò)增出合適的條帶，故采取降落PCR，提高序列配對(duì)的準(zhǔn)確性，同時(shí)采用二次擴(kuò)增，將一次擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100倍后作為模板進(jìn)行二次擴(kuò)增，來(lái)富集目的片段這樣的擴(kuò)增效果可以較好可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同退火溫度對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶擴(kuò)增的影響

2.2 未處理下Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄活性

在該實(shí)驗(yàn)中，我們以未處理的白樺愈傷組織的RNA為模版，通過(guò)RT－PCR擴(kuò)增獲得了一條大小為290 bp的序列，通過(guò)blastn和blastx證實(shí)其為T(mén)y1－copia類逆轉(zhuǎn)座子的逆轉(zhuǎn)錄酶基因的片段，blastx與Alstroemeria inodora的同源性為74%，命名為Bprt1。該序列包含下游YVDDML保守基序，但是上游的保守基序?yàn)門(mén)AFFHG，而非TAFLHG，有一個(gè)氨基酸的突變，即亮氨酸(L)突變?yōu)楸奖彼?F)，均為疏水氨基酸，屬于保守替換。從核酸的角度則是從CTT突變?yōu)門(mén)TT。另外，Bprt1存在一個(gè)終止密碼子。

應(yīng)用DNAMAN軟件對(duì)Bprt1的氨基酸序列比對(duì)(如圖2)，參與比對(duì)的序列有擬南芥逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 AAF02855、黑楊 CAC95126、果蠅 P04146、柑橘CAJ09951、番 茄 AAK29467、煙 草 P10978、煙 草BAA11674和玉米AAA57005等8種生物中逆轉(zhuǎn)座子的逆轉(zhuǎn)錄酶片段，其一致性為63.89%，Bprt1跟它們的同源性分別為 47.37%、41.49%、37.23%、52.63%、57.89%、61.05%、58.95%、38.95%。應(yīng)用軟件DNAMAN對(duì)Bprt1和8種生物的逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(如圖3)發(fā)現(xiàn)雖然白樺與黑楊的親緣關(guān)系最近，但是其對(duì)應(yīng)的RT基因的親緣性并非最近。

圖2 Bprt1與另外8種生物中Ty1－copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列比對(duì)

圖3 白樺Bprt1與其他生物Ty1－copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 SNP和MeJA處理后Ty1－copia類逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄活性

在該實(shí)驗(yàn)中，隨機(jī)挑取以2 mmol·L－1SNP進(jìn)行處理12 h的白樺愈傷組織cDNA獲得的11個(gè)白色單克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得11條核酸序列，除一條為205 bp外，其他10條均在270 bp左右，經(jīng)blastn和blastx比對(duì)后確定為T(mén)y1－copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因，命名為Bprt2～Bprt12，核酸序列比對(duì)后一致性為 78.79%，如圖 4，異質(zhì)性為 1.1%～43.1%。隨機(jī)挑取以1 mmol·L－1MeJA處理12 h的愈傷組織cDNA為模版獲得的10個(gè)白色單克隆，得到的10條核酸序列中有兩條是完全一樣的，認(rèn)為得到9條核酸序列，其大小均在270 bp左右，符合預(yù)期，經(jīng)blastn和blasrx比對(duì)后確定為T(mén)y1－copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因，命名為Bprt13～Bprt21，核酸序列比對(duì)后一致性為83.41%，如圖5，其異質(zhì)性為 1.1%～50%。如圖6，比對(duì)獲得的21條核酸序列，其一致性為 71.93%，異質(zhì)性為 1.1% ～50.9%，翻譯成氨基酸的異質(zhì)性為0～57.1%，說(shuō)明逆轉(zhuǎn)座子具有高度的異質(zhì)性。

如圖7，應(yīng)用DNAMAN對(duì)獲得的21條轉(zhuǎn)基因白樺中Ty1－copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶片段構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)SNP誘導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄酶序列Bprt3、Bprt4、Bprt10、Bprt6、Bprt8 聚在一起，Bprt9和Bprt11聚在一起，Bprt7和 Bprt12聚在一起;而經(jīng)MeJA誘導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄酶序列Bprt13、Bprt17和Bprt18聚在一起、Bprt15和Bprt20聚在一起。說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子能夠響應(yīng)不同的信號(hào)而被激活，并且不同的誘導(dǎo)處理基本會(huì)使逆轉(zhuǎn)座子各自聚類。

2.4 白樺和蘋(píng)果Ty1－copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列的比對(duì)分析

轉(zhuǎn)座子的水平傳遞成為了不同物種間聯(lián)系的橋梁，在植物、動(dòng)物和微生物中都能檢測(cè)到同一類的逆轉(zhuǎn)座子，并且具有較高的相似性。高等植物同類型的逆轉(zhuǎn)座子在縱向和橫向傳遞過(guò)程中產(chǎn)生高度異質(zhì)性［13］，這種異質(zhì)性有時(shí)種內(nèi)差異大于種屬間［14］。本實(shí)驗(yàn)以白樺及蘋(píng)果為例分析了逆轉(zhuǎn)座子縱向傳遞的異質(zhì)性和一致性。

圖4 SNP誘導(dǎo)下白樺中Bprt2～Bprt12核酸序列比對(duì)

圖5 MeJA誘導(dǎo)下白樺中Bprt13～Bprt21核酸序列比對(duì)

圖6 白樺中Bprt1～Bprt21核酸序列比對(duì)

圖7 白樺Bprt1～Bprt21逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

我們從GENEBANK中下載了蘋(píng)果(Malus×domestica Borka.)中的19條 Ty1－copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列，序列號(hào)為DQ410748～DQ410766，其異質(zhì)性為21.3%～52.3%，將本實(shí)驗(yàn)得到的21條序列與這19條的核酸序列比對(duì)，一致性為61.30%(如圖8)，種間異質(zhì)性為 28.2%～52.5%。進(jìn)化樹(shù)分析，如圖9，白樺和蘋(píng)果中Ty1－copia類逆轉(zhuǎn)座子基本各自聚類，但是 Bprt9、Bprt11和 DQ410750進(jìn)化關(guān)系比較接近聚為一類，Bprt15、Bprt19、DQ410751 和DQ410753的進(jìn)化關(guān)系也比較接近。說(shuō)明了逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子種內(nèi)變異較大，而且種間變異也較大，但是種內(nèi)變異可能大于種間。證明了逆轉(zhuǎn)座子不僅存在垂直傳遞，也存在水平傳遞。

圖8 白樺Bprt1－Bprt21和蘋(píng)果DQ410748～DQ410766的核酸序列比對(duì)

圖9 白樺Bprt1～Bprt21和蘋(píng)果DQ410748～DQ410766逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 結(jié)論與討論

簡(jiǎn)并度是簡(jiǎn)并引物的種類數(shù)，是該簡(jiǎn)并引物內(nèi)所有簡(jiǎn)并堿基的簡(jiǎn)并個(gè)數(shù)之積。本研究中采用CODEHOP設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，所用的上游引物的簡(jiǎn)并度為128、下游引物的簡(jiǎn)并度也為128，簡(jiǎn)并度較大，退火溫度為45℃，比較低，退火溫度的不適宜即過(guò)高會(huì)使PCR效率過(guò)低，過(guò)低則會(huì)使非特異擴(kuò)增過(guò)多均會(huì)對(duì)后面克隆測(cè)序的結(jié)果產(chǎn)生影響。而且RT－PCR第一步獲得的cDNA的濃度也較低，因此在實(shí)驗(yàn)中結(jié)合梯度PCR和降落PCR提高準(zhǔn)確性，采用二次PCR使PCR產(chǎn)物富集提高濃度，達(dá)到的效果比較好。并且前后兩次采用同樣的引物序列對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有影響。

詹亞光等［15］于2001年開(kāi)始通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法首次將bgt基因成功轉(zhuǎn)入白樺中，并獲得抗性植株，而基因沉默首先也是在轉(zhuǎn)基因植物中發(fā)現(xiàn)的，而轉(zhuǎn)基因植物是否成功不僅僅是在轉(zhuǎn)基因植株中檢測(cè)到外源基因，更重要的是外源基因能夠在植株中穩(wěn)定表達(dá)。而轉(zhuǎn)基因植株中常常會(huì)出現(xiàn)外源基因沉默的現(xiàn)象。而甲基化導(dǎo)致外源基因沉默也是一個(gè)抑制逆轉(zhuǎn)座子活性的重要調(diào)節(jié)機(jī)制，而轉(zhuǎn)座活性經(jīng)常與甲基化不足聯(lián)系在一起［16］，例如對(duì)去甲基化突變的研究表明轉(zhuǎn)座子和/或逆轉(zhuǎn)座子能夠在轉(zhuǎn)錄甚至在轉(zhuǎn)座水平上被激活，因而有力的證明胞嘧啶甲基化和轉(zhuǎn)座子的表達(dá)調(diào)控有密切的聯(lián)系［17］，并且逆轉(zhuǎn)座子的重復(fù)或插入也可誘導(dǎo)外源基因的基因沉默。隨著植物基因工程研究的深入，人們開(kāi)始關(guān)注外源基因在轉(zhuǎn)化體及其子代中的整合穩(wěn)定性和表達(dá)有效性，從外源基因的整合特性、甲基化、外界因素等表觀遺傳的角度研究其表達(dá)狀況。本文選取白樺為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行研究，也是為后續(xù)對(duì)轉(zhuǎn)基因白樺中逆轉(zhuǎn)座子DNA序列中胞嘧啶甲基化的頻率、重復(fù)序列的插入或者缺失以及逆轉(zhuǎn)座子的活性與外源基因的表達(dá)關(guān)系的研究奠定基礎(chǔ)為轉(zhuǎn)基因植株外源基因表達(dá)穩(wěn)定性提供參考依據(jù)。

在通常情況下，逆轉(zhuǎn)座子在植物中是沒(méi)有轉(zhuǎn)錄活性的，而只有受到生物或非生物脅迫后才可以被轉(zhuǎn)錄激活。SNP處理白樺懸浮細(xì)胞可以有效提高異黃酮等次生代謝產(chǎn)物的積累，而茉莉酸甲酯處理可以提高三萜類物質(zhì)、齊墩果酸和白樺脂醇等次生代謝產(chǎn)物的含量［18］，而異黃酮、三萜類物質(zhì)、齊墩果酸和白樺脂醇都具有很高的藥用價(jià)值。本文采用SNP和MeJA誘導(dǎo)處理，分別克隆回收到了11條和9條有轉(zhuǎn)錄活性的逆轉(zhuǎn)座子，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)應(yīng)用不同的脅迫誘導(dǎo)處理會(huì)聚集不同逆轉(zhuǎn)座子，初步證明不同的Tyl－copia類逆轉(zhuǎn)座子能夠分別響應(yīng)不同的信號(hào)而被轉(zhuǎn)錄激活。有研究表明，逆轉(zhuǎn)座子有捕捉植株內(nèi)源基因的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的能力［19］，從而提高某些基因的表達(dá)。然而，白樺次生代謝產(chǎn)物的積累與逆轉(zhuǎn)座子之間的作用機(jī)理，還有待進(jìn)我們一步的研究。

同一植物內(nèi)逆轉(zhuǎn)座子保守性較強(qiáng)如Bprt6和Bprt10的一致性高達(dá)98%。但同一植物內(nèi)的同一類型逆轉(zhuǎn)座子序列變異也較大，如Bprt1和Bprt15的一致性為50%;而不同物種間逆轉(zhuǎn)座子卻也可能有很高的相似性，這在其他物種上也得到了驗(yàn)證［20－21］。Asins等［22］人研究發(fā)現(xiàn)柑橘基因組已經(jīng)積累了豐富的逆轉(zhuǎn)座子并且這些逆轉(zhuǎn)座子很可能是由病毒或病原菌為媒介在物種間傳遞而來(lái)。而本實(shí)驗(yàn)中Bprt1與DQ410750一致性達(dá)到70%，這種相似性可能是逆轉(zhuǎn)座子間“橫向傳遞”的結(jié)果，這為研究物種的起源、進(jìn)化途徑提供了依據(jù)。

［1］ Kumar A，Bennetzen J L.Plant retrotransposons［J］.Annu Rev Genet，1999，33:479－532.

［2］ Voytas D F，Cummings M P，Konerczny A K，et al.Copia-like retrotransposons are ubiquitous among plants［J］.Proc Natl Acid Sci USA，1992，89(15):7124－7128.

［3］ Kumar A.The adventures of the Ty1-copia group of retrotransposons in plants［J］.Trends Genet，1996，12(2):41－43.

［4］ Grandbastien M A，Spielmann A，Caboche M.et al.A mobile retroviral-like transposable element of tobacco isolated by plant cell genetics［J］.Nature，1989，337:377－380.

［5］ Grandbastien M A.Activation of plant retrotransposons under stress conditions［J］.Trends Plant Sci，1998，3(5):181－187.

［6］ Okamoto H.Efficient insertion mutagenesis of Arabidopsis by tissue culture-induced activation of thetobacco retrotransposon Tto1［J］.Plant Journal，2000，23(2):291－304.

［7］ Sakamoto K，Ohmido N，F(xiàn)ukui K，et al.Site-specific accumulation of a line-like retrotransposon in a sex chromosome of the dioecious plant Cannabis sativa［J］.Plant Molecular Biology，2000，44(6):723－732.

［8］ Beguiristain T，Grandbastien M A，Puigdomenech P，et al.Three Tnt1 subfamilies show different stress-associated patterns of expression in tobacco:consequences for retrotransposon，control and evolution in plants［J］.Plant Physiology，2001，127(1):212－221.

［9］ 孫俊，房經(jīng)貴，高兵，等.蘋(píng)果中Ty1－copia型逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列的克隆及分析［J］.果樹(shù)學(xué)報(bào)，2005，22(3):193－197.

［10］ Kimur Y，Tosa Y，Shimada S，et al.OARE-1，a Ty1-copia retrotransposon in oat activated by abiotic and biotic stress［J］.Plant and Cell Physiology，2001，42(12):1345－1354.

［11］ 曾凡鎖，南楠，詹亞光.富含多糖和次生代謝產(chǎn)物的白樺成熟葉中總RNA的提取［J］.植物生理學(xué)通訊，2007，43(5):913－916.

［12］ Kumar A，Pearce S R，McLean K，et al.The Ty1-copiagroup of retrotransposons in plants:genomic organization evolution and use asmolecularmarkers［J］.Genetica，1997，100:205－217.

［13］ Vershinin A V，Ellis T H N.Heterogenity of the inernal structure of PDR1，a family of Ty1-copiaretrotransposons in pea［J］.Molecular and General Genetics，1999，262(45):703－713.

［14］ 孫俊.蘋(píng)果Ty1－copia類逆轉(zhuǎn)座子的特性及其在蘋(píng)果屬遺傳多樣性分析中的應(yīng)用［D］.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

［15］ 詹亞光，王玉成，王志英，等.白樺的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲(chóng)性［J］.植物生理及分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，2003，29(5):380－386.

［16］ 唐益達(dá)，馬有志.苗植物反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子及其在功能基因組學(xué)中的應(yīng)用［J］.植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2005，6(2):221－225.

［17］ 劉曉冬.人參和西洋參Ty1/copia－like反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)座酶序列的克隆和分析［D］.長(zhǎng)春:東北師范大學(xué)，2005.

［18］ 李春曉，尹靜，詹亞光，等.水分、氮肥及MeJA處理對(duì)白樺三萜積累特性的影響［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2012，32(1):155－161.

［19］ Grandbastien M A，Lucas H，Morel J B，et al.The expression of the tobacco Tnt1 retrotransposon is linked to plant defense reponses［J］.Genetica，1997，100:241－252.

［20］ 江彪，婁群峰，刁衛(wèi)平，等.黃瓜屬Ty1－copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列的克隆及分析［J］.園藝學(xué)報(bào)，2008，35(8):1147－1154.

［21］ 肖棟，侯喜林，馬景蕃，等.不結(jié)球白菜Ty1－copia類逆轉(zhuǎn)座子序列的克隆及表達(dá)［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2009，29(4):643－649.

［22］ Asins M J，Monforte A J，Mestre P F.Citrus and prunus copialike retrotransposons［J］.Theor Appl Genet，1999，99:503－510.