聚酰胺固相萃取法檢測動物源食品中全氟辛酸和全氟辛烷磺酸

林 欽

(福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，福建 福州 350002)

近年來，全氟化合物(PFCs)因其具有很高的化學(xué)穩(wěn)定性和難以生物降解，被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)涂料、裝潢材料、塑料、包裝材料等。同時全氟物質(zhì)的殘留問題也日益引起全球的廣泛關(guān)注。研究表明，全氟辛酸(foods of animal origin; perfluorooctanoic acid，PFOA)和全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulphonic acid，PFOS)具有遺傳毒性、雄性生殖毒性、神經(jīng)毒性、發(fā)育毒性和內(nèi)分泌干擾作用等多種毒性，被認(rèn)為是一類具有全身多器臟毒性并能引起癌變的環(huán)境污染物[1-2]。因此，開展動物源產(chǎn)品中全氟化合物PFOA、PFOS殘留的檢測方法研究，對于研究全氟化合物PFOA、PFOS的污染狀況并制定相關(guān)產(chǎn)品的限量指標(biāo)具有積極的意義。

目前，國內(nèi)有關(guān)全氟化合物的報道主要著重于研究全氟化合物對環(huán)境的污染情況及對紡織品、皮革制品中及環(huán)境水樣和污泥中全氟化合物的檢測，測定方法主要有高效液相/四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法[3]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)[4-11]和氣相色譜法[12-14]等。迄今為止，我國已發(fā)布了多個針對食品包裝材料、食品接觸材料和化工產(chǎn)品等的PFOA、PFOS殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)[15-17]，但尚未出臺食品中全氟化合物測定的標(biāo)準(zhǔn)方法。由于食品普遍存在著全氟化合物的污染，而食品的種類繁多，基體的干擾因素很多且各不相同，這對樣品的提取技術(shù)和凈化技術(shù)都提出了很高的要求。目前對食品中全氟化合物的檢測方法報道還較少。本實(shí)驗重點(diǎn)研究動物源產(chǎn)品中全氟化合物PFOA、PFOS殘留的樣品處理技術(shù)、不同基體的干擾及消除，在此基礎(chǔ)上建立UPLC-MS/MS測定動物源食品中PFOA、PFOS的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所用試劑除特別標(biāo)注外均為分析純，水為超純水；甲醇、乙腈(色譜純) 山東禹王集團(tuán)；全氟辛酸(CAS 335-67-1，C8HF15O2，純度98.0%)、全氟辛烷磺酸鉀(CAS 2795-39-3，C8HF17O3S.K，純度98.5%) 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity UPLC系統(tǒng)(配有Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀) 美國Waters公司；Avanti J-E冷凍高速離心機(jī) 美國貝克曼公司；12管固相萃取裝置 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取30.0mg全氟辛酸和全氟辛烷磺酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品，加入甲醇溶解、定容到100mL作為混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，準(zhǔn)確移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇溶液稀釋成1～60ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列。

聚酰胺固相萃取小柱制作：取3mL的固相萃取用空柱，下端放一篩板，將100～200目的聚酰胺粉加入甲醇成漿狀，濕法裝填，使上篩板用玻璃棒壓實(shí)后聚酰胺填料的厚度約為2cm，使用前用3mL體積分?jǐn)?shù)5%的氨水-甲醇溶液、3mL甲醇和3mL體積分?jǐn)?shù)為0.5%的甲酸溶液活化。

酸化乙腈：500mL乙腈+2.5mL甲酸。

1.3.2 樣品處理

取約200g樣品破碎均勻，稱取5.00g樣品，置于50mL離心管中，加入20.0mL酸化乙腈，旋緊蓋子，振搖混勻，置于超聲波振蕩器中提取30min，取出，再加入2.0g氯化鈉，振搖1min，于4℃，15000r/min離心5min，取5.0mL上清液于50mL試管中，再加入10mL 0.5%甲酸混勻，將溶液通過聚酰胺小柱，控制流速1～2mL/min，用3mL水和2mL 30%甲醇淋洗小柱，抽干，用3.0mL 5%氨水-甲醇洗脫并收集，置于40℃水浴中氮吹近干，再用50%甲醇定容到2.0mL，混勻，用0.2μm聚四氟乙烯(PTFE)濾膜過濾后檢測。

1.3.3 液相色譜分析條件

色譜柱：Waters BEH C18(100mm×2.1mm，1.7μm)；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μL；流速：0.3mL/min；流動相及梯度：A為5mmol/L乙酸銨-甲醇(95：5，V/V)溶液，B為甲醇；0～0.8min，35% A～30% A；0.8～1.5min，30% A；1.5～3.0min，30% A～10% A；3.0～3.5min，10% A；3.5～5.5min，35% A。

1.3.4 質(zhì)譜分析條件

電離源：大氣壓電噴霧離子源負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓3.00kV；源溫度120℃；脫溶劑氣溫度350℃；脫溶劑氣流量700L/h；錐孔反吹氣流量50L/h；碰撞室壓力2.7×10-3mbar；電子倍增管電壓800V；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(multi reaction monitoring，MRM)模式；特征離子見表1。

表1 主要質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters for analysis of PFOA and PFOS

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

圖 1 PFOA和PFOS質(zhì)譜分析圖 Fig.1 Mass spectra of PFOA and PFOS

配制5μg/mL PFOA和PFOS標(biāo)準(zhǔn)溶液，由注射泵直接進(jìn)樣，首先作一級質(zhì)譜全掃描，掃描結(jié)果在ESI模式下，PFOA母離子為m/z 413.0，PFOS母離子為m/z 498.8。再對母離子進(jìn)行子離子掃描，通過優(yōu)化碰撞能量等參數(shù)得到PFOA和PFOS的子離子掃描質(zhì)譜圖(圖1)，最終確定PFOA和PFOS的定量和定性子離子及相應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本方法采用超高效液相色譜技術(shù)和1.7μm粒徑的C18色譜柱，具有極高的分離效率，在考慮色譜柱的耐酸堿性能基礎(chǔ)上，研究純水-甲醇體系、0.02%氨水-甲醇體系和5mmol/L乙酸銨-甲醇體系作為流動相的分離效果，實(shí)驗發(fā)現(xiàn)5mmol/L乙酸銨-甲醇體系具有最佳的峰形和靈敏度。調(diào)整5mmol/L乙酸銨-甲醇洗脫梯度為1.3.3節(jié)條件時，全氟辛酸(tR=1.8min)和全氟辛烷磺酸(tR=2.3min)的色譜分離圖見圖2。

圖 2 PFOA(38ng/mL)和PFOS(39ng/mL)的選擇離子監(jiān)測圖及總離子流圖Fig.2 MRM and TIC chromatograms of PFOA (38 ng/mL) and PFOS (39 ng/mL)

2.3 試樣前處理條件的選擇

2.3.1 提取液的選擇

由于水產(chǎn)品、牛奶等動物源食品的含水量較大，因此，實(shí)驗中采用乙腈提取樣品后加入2g氯化鈉鹽析分離水和乙腈。采用牡蠣加標(biāo)樣品比較乙腈和酸化乙腈的提取效果，結(jié)果表明采用酸化乙腈提取法具有更高、更穩(wěn)定的回收率(表2)。

表2 不同提取液對全氟辛酸和全氟辛烷磺酸的回收率比較(n=3) Table 2 Effect of extraction solvent on the recovery rates of PFOA and PFOS (n=3)

2.3.2 固相萃取凈化柱的選擇

目前，文獻(xiàn)報道的全氟辛酸和全氟辛烷磺酸固相萃取柱主要有Oasis HLB柱[3]和Oasis WAX柱[5-7]。由于這兩種固相萃取小柱的價格均較昂貴，因此，本實(shí)驗研究了價格低廉的中性氧化鋁和聚酰胺填料對全氟辛酸和全氟辛烷磺酸的吸附效果。實(shí)驗發(fā)現(xiàn)全氟辛酸能被中性氧化鋁吸附而全氟辛烷磺酸不被保留；同時，實(shí)驗發(fā)現(xiàn)在酸性條件下，全氟辛酸和全氟辛烷磺酸均能被聚酰胺填料牢固吸附而在堿性條件下脫附。最后，實(shí)驗針對聚酰胺固相萃取柱的裝填、過柱溶液、淋洗液和洗脫液進(jìn)行了優(yōu)化。

2.3.2.1 填料厚度的選擇

實(shí)驗使用3mL固相萃取柱，下端放一篩板，將100～200目的聚酰胺粉加入甲醇成漿狀，采用濕法裝填，上篩板用玻璃棒壓實(shí)。比較1.0、1.5cm和2.0cm三種厚度的聚酰胺小柱萃取效果，回收率見表3。

由表3可知，1.5cm和2.0cm的聚酰胺小柱對全氟辛酸和全氟辛烷磺酸均有90%以上的回收率，而1.0cm的聚酰胺小柱對全氟辛酸回收率低于70%，因此，為了保證回收結(jié)果的穩(wěn)定性，最后確定采用2.0cm的聚酰胺小柱。

表3 不同填料厚度對全氟辛酸和全氟辛烷磺酸的回收率比較(n=3) Table 3 Effect of packing height of column on the recovery rates of PFOA and PFOS (n=3)

2.3.2.2 提取液加酸化水稀釋比例選擇

取2.0mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，按體積比1：1、1：2和1：3的比例用0.5%甲酸稀釋后過聚酰胺柱處理后檢測，PFOA的回收率為92.0%、100.5%和100.6%，PFOS的回收率為96.3%、100.0%和100.3%，可見采用1：2的稀釋比例過柱，PFOA和PFOS的回收率就可以達(dá)到100%，因此，最終采用1：2的稀釋比例。

2.3.2.3 淋洗液的選擇

為了盡可能去除雜質(zhì)的干擾，實(shí)驗比較3mL水淋洗、2mL 30%甲醇淋洗、2mL 50%甲醇淋洗和1mL甲醇淋洗的回收率結(jié)果，PFOA的回收率為99.2%、96.9%、88.1%和71.4%，PFOS的回收率為99.1%、95.3%、93.0%和88.0%，為確保PFOA和PFOS的回收率，最終采用3mL水淋洗后再用2mL 30%甲醇淋洗的凈化方法。

2.3.2.4 洗脫液體積的選擇

實(shí)驗采用5%氨水-甲醇作為洗脫劑，比較1.0、2.0mL和3.0mL洗脫劑的洗脫效果，PFOA的回收率為90.2%、100.8%和99.1%，PFOS的回收率為32.1%、74.8%和99.2%，可見洗脫劑體積對PFOS的回收率有很大的影響，因此，最終確定使用3.0mL 5%氨水-甲醇洗脫聚酰胺小柱。

2.3.2.5 定容液的選擇

實(shí)驗發(fā)現(xiàn)用甲醇或乙腈溶解樣品，進(jìn)樣10μL時，PFOA和PFOS的色譜峰發(fā)生嚴(yán)重的擴(kuò)展，無法進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量；但隨著溶劑中水含量的提高，色譜峰的展寬得到改善。實(shí)驗比較了純水、20%甲醇、50%甲醇和75%甲醇作為溶劑的出峰效果，選取50%甲醇作為溶劑，既能保證良好的峰形，又能讓樣品溶液易于過濾。

2.3.2.6 凈化效果的比較

實(shí)驗將該富集、凈化方法與目前普遍采用的Oasis WAX 60mg/3mL弱陰離子交換固相萃取法進(jìn)行比較，回收率結(jié)果見表4。

表4 不同萃取柱對全氟辛酸和全氟辛烷磺酸的回收率比較(n=3) Table 4 Effect of SPE column type on the recovery rates of PFOA and PFOS (n=3)

由表4可知，聚酰胺固相萃取法具有更好的回收效果，而其成本只有Oasis HLB柱和Oasis WAX柱的十分之一甚至更低。

2.4 線性范圍

取標(biāo)準(zhǔn)儲備液用50%甲醇配成1～60ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，以PFOA和PFOS的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制PFOA和PFOS的工作曲線，得到PFOA的線性回歸方程為Y＝8.34×102X＋4.66×102，r＝0.9999；PFOS的線性回歸方程為Y＝2.82×102X＋61.2，r＝0.9999。全氟辛酸和全氟辛烷磺酸在1～60ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

2.5 檢測限

按1.3.2節(jié)得到1.22ng/mL PFOA樣品提取溶液的峰峰信噪比RSN為30.56；1.26ng/mL PFOS樣品提取溶液的峰峰RSN為30.50，按RSN=3計，本方法PFOA和PFOS的檢測限均為0.2μg/kg。

2.6 回收率和精密度實(shí)驗

取不含全氟辛酸和全氟辛烷磺酸的豬肉、雞肉、牡蠣、魚罐頭、豬肉罐頭和奶粉6種樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)添加實(shí)驗，每個添加量做5個平行，結(jié)果見表5。該方法對6種動物源食品中全氟辛酸和全氟辛烷磺酸的回收率在93.3%～102.8%之間，精密度在0.8%～6.2%之間。

表5 不同食品中全氟辛酸和全氟辛烷磺酸的加標(biāo)回收率和精密度(n=5)Table 5 Recovery rates and precision for determination of PFOA and PFOS in different food samples (n=5)

2.7 實(shí)際樣品檢測

實(shí)驗對多種陸生動物和水生動物及其制品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)多數(shù)樣品存在全氟辛酸污染，含量多在0.5μg/kg以下，但有少數(shù)罐頭食品可能受罐頭盒內(nèi)壁涂層污染，全氟辛酸的含量可達(dá)40μg/kg，該陽性樣品譜圖見圖3，空白魚罐頭樣品總離子流圖見圖4。

圖 3 陽性樣品的選擇離子監(jiān)測圖和總離子流圖Fig.3 TIC and MRM chromatograms of positive samples

圖 4 空白魚罐頭樣品的總離子流圖Fig.4 TIC chromatograms of blank canned fish

3 結(jié) 論

聚酰胺固相萃取富集、凈化動物源食品中全氟辛酸和全氟辛烷磺酸并采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀進(jìn)行快速檢測，該方法前處理成本低、效果好、檢測時間短、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)，在調(diào)查動物源食品中全氟辛酸和全氟辛烷磺酸污染狀況的檢驗工作中具有很好的應(yīng)用價值。

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