黑曲霉H1-9b發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖氧化酶的工藝優(yōu)化

唐 菁，趙 芯，蘇 茉，唐云明*

(西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715)

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)是一種需氧脫氫酶，它能利用分子氧作為電子受體，專一催化β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和過氧化氫[1]。這種酶廣泛應(yīng)用于工業(yè)、食品加工、釀酒[2]及醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)[3-5]。葡萄糖氧化酶在工業(yè)生產(chǎn)中多以黑曲霉(Aspergillus niger)、點(diǎn)青霉 (Penicilliun notatun)等微生物為主要來源[6]。表面活性劑具有乳化和分散的作用，在發(fā)酵過程中可以改善氣液表面的狀態(tài)以及發(fā)酵液流動(dòng)性的功能，也具有改變細(xì)胞膜通透性的功能。本實(shí)驗(yàn)篩選獲得一株葡萄糖氧化酶的高產(chǎn)菌株，黑曲霉H1-9b(20U/mL)，與Petruccioli等[7]研究得出的5.49U/mL和Khattab等[8]測(cè)得的最大酶活力15.9U/mL相比，該菌株在產(chǎn)酶能力上有較大優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)以黑曲霉H1-9b為出發(fā)菌株，采用單因素和正交設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵條件，并通過向培養(yǎng)基中添加表面活性劑，提高單位體積發(fā)酵液的葡萄糖氧化酶產(chǎn)量，以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

菌種為本實(shí)驗(yàn)室分離保藏的菌株黑曲霉H1-9b[9]。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：察氏(Czapek)培養(yǎng)基[10]；發(fā)酵培養(yǎng)基：采用本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化后的培養(yǎng)基，即含葡萄糖80g/L、蛋白胨2g/L、NaNO35g/L、KH2PO40.7g/L、KCl 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L，pH值自然。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)

活化培養(yǎng)：挑1環(huán)孢子接種于斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h。

孢子懸液制備：取活化的斜面培養(yǎng)的1支，加入無菌水洗下孢子，制成孢子懸液，采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法調(diào)整孢子濃度為106個(gè)/mL。

發(fā)酵培養(yǎng)：250mL的三角瓶中裝入50mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，于28℃搖床上200r/min振蕩培養(yǎng)78h。

1.3.2 粗酶液制備

1.3.2.1 菌絲體粗酶液制備

搖床發(fā)酵培養(yǎng)完成后，用紗布過濾發(fā)酵液，收集球狀菌絲體，用雙蒸水將其反復(fù)沖洗，直至把發(fā)酵液沖洗干凈；再用0.2mol/L pH5.7的磷酸緩沖液沖洗菌絲體，壓干水分，稱質(zhì)量。將菌絲體置于研缽中，加入適量石英砂，對(duì)菌體進(jìn)行研磨；充分研磨后按1：1(m/V)加入預(yù)冷的0.05mol/L pH5.7的磷酸緩沖液浸酶，4℃抽提2h。抽提完成后在4℃、12000r/min的條件下離心20min，取上清，于4℃保存。

1.3.2.2 發(fā)酵液粗酶液制備

發(fā)酵液先用兩層紗布過濾，濾液冷凍離心，條件為4℃、10000r/min離心15min，取上清，于4℃保存。

1.3.3 酶活力測(cè)定參照文獻(xiàn)[4,11]的方法并加以改進(jìn)，取適當(dāng)稀釋后酶液50μL，加入2.0mL 0.1mol/L pH5.7的磷酸緩沖溶液、0.3mL 10%葡萄糖溶液、50μL 16mmol/L 4-氨基安替吡啉、50μL 7.5mmol/L苯酚、50μL 1000U/mL的過氧化物酶，在37℃條件下，準(zhǔn)確反應(yīng)4min，再置于沸水浴中快速滅活4min，冷卻至室溫，在500nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度；用預(yù)先滅活的酶液作空白對(duì)照，其他處理?xiàng)l件相同。酶活力單位(U)定義為：每分鐘消耗1μmol葡萄糖所需要的酶量為1個(gè)活力單位。

1.3.4 蛋白質(zhì)的含量

采用紫外分光光度法[12]測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.3.5 菌體干質(zhì)量測(cè)定[13]

將經(jīng)兩層紗布過濾后的菌絲體，用蒸餾水沖洗2次，于55℃烘箱中干燥至質(zhì)量恒定后稱質(zhì)量。

1.3.6 不同發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)酶的影響[14]

1.3.6.1 轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響

以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，裝液量為250mL三角瓶中發(fā)酵液50mL，接種200μL孢子懸液，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為1～4組，分別為150、200、250、300r/min，28℃振蕩培養(yǎng)78h。每組處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.6.2 初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

用0.1mol/L的HCl溶液和0.1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)，使發(fā)酵液初始pH值為3～8，0.5為1個(gè)pH值間隔，各組pH值重復(fù)3次。搖床轉(zhuǎn)速為250r/min，28℃振蕩培養(yǎng)78h。

1.3.6.3 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，接種量設(shè)定為10、50、100、150、200、250、300μL孢子懸液，每組水平重復(fù)3次。初始pH4.5，裝液量為250mL三角瓶中發(fā)酵液50mL，搖床轉(zhuǎn)速為250r/min，28℃振蕩培養(yǎng)78h。

1.3.6.4 裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響

設(shè)定250mL三角瓶中所含的發(fā)酵液為20、40、50、60、80、100、120、140mL，每組水平重復(fù)3次。接種量為250μL孢子懸液，搖床轉(zhuǎn)速為250r/min，28℃振蕩培養(yǎng)78h。

1.3.6.5 表面活性劑對(duì)產(chǎn)酶的影響

向基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.5%的吐溫-20、吐溫-80和Triton X-100來考察表面活性劑種類對(duì)產(chǎn)酶的影響。搖床轉(zhuǎn)速為250r/min，28℃振蕩培養(yǎng)78h。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，參考文獻(xiàn)[15]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化研究

2.1.1 轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響

黑曲霉為專性好氧菌，孢子的萌發(fā)、菌體的繁殖和酶的合成都需要氧氣。三角瓶中的發(fā)酵液在搖床上振蕩，產(chǎn)生氣液的混合和分散，使空氣中的氧有效地溶解。因此，搖床轉(zhuǎn)數(shù)影響菌體的生產(chǎn)和酶的產(chǎn)量。由圖1可知，最適轉(zhuǎn)速為200r/min。若轉(zhuǎn)速低于200r/min，由于通氧差，產(chǎn)酶量降低；隨著轉(zhuǎn)速的增加，剪切力增大而影響菌體生長(zhǎng)，產(chǎn)酶量也隨之下降。

圖 1 轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of rotation speed on glucose oxidase production

2.1.2 初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖 2 初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of initial pH on glucose oxidase production

初始pH值會(huì)影響菌的代謝途徑和生長(zhǎng)速率[16]，從而影響菌的生長(zhǎng)和酶的合成。黑曲霉在pH1.5～9.0的范圍內(nèi)都能生長(zhǎng)[17]。由圖2可知，黑曲霉H1-9b在初始pH值為3～8的范圍內(nèi)都能生長(zhǎng)，最適pH值為4.5。當(dāng)初始pH＞7時(shí)，黑曲霉H1-9b基本貼壁生長(zhǎng)；當(dāng)初始pH＜4.5時(shí)，這由于菌代謝產(chǎn)酸，進(jìn)一步降低發(fā)酵液pH值，影響跨膜pH值梯度，引起菌體膜滲透性的變化，從而影響菌對(duì)養(yǎng)分的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌，導(dǎo)致產(chǎn)酶量不高。

2.1.3 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖 3 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of inoculum amount on glucose oxidase production

接種量影響菌生長(zhǎng)達(dá)到高峰的時(shí)間，從而影響產(chǎn)物的合成。由圖3可知，接種量為250μL時(shí)，其酶活力最高。接種量＜100μL時(shí)產(chǎn)酶量較低，可能原因是菌絲體生長(zhǎng)過慢，需要較長(zhǎng)的發(fā)酵時(shí)間才能達(dá)到最大菌絲生物量，從而影響了產(chǎn)酶量；接種量＞250μL時(shí)，產(chǎn)酶量也隨之降低，可能是由于菌體生長(zhǎng)過快，發(fā)酵液黏度增加，導(dǎo)致溶氧不足，影響葡萄糖氧化酶的合成。

2.1.4 裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響

裝液量的多少直接影響溶氧水平，從而影響菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。由圖4可知，當(dāng)裝液量為80、100、120mL時(shí)，酶活力較高。當(dāng)裝液量為140mL時(shí)，酶活力降低，這主要是因?yàn)殡S著裝液量的增加，體積溶氧系數(shù)降低，導(dǎo)致黑曲霉生長(zhǎng)所必需的氧供應(yīng)不足，從而導(dǎo)致產(chǎn)酶量降低。

圖 4 裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of broth amount on glucose oxidase production

2.1.5 正交試驗(yàn)[18]優(yōu)化發(fā)酵工藝

選用L9(34)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，對(duì)接種量、裝液量、初始pH值以及轉(zhuǎn)速這4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，見表1，初始pH值是影響搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的最主要因素，而影響搖瓶發(fā)酵的最小因素為接種量。A1B2C2D1為最佳組合，即轉(zhuǎn)速200r/min、初始pH5.3、接種量200μL孢子懸液、裝液量80mL。

表 1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Design and results of orthogonal tests

2.2 表面活性劑對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.2.1 表面活性劑種類對(duì)產(chǎn)酶的影響

表面活性劑一方面具有改善細(xì)胞膜通透性，減少氧及營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的傳遞阻力，加快物質(zhì)傳遞運(yùn)輸?shù)哪芰Γ涣硪环矫鎸?duì)微生物有毒性和殺菌作用[19]。黑曲霉H1-9b產(chǎn)的葡萄糖氧化酶為胞內(nèi)酶，考慮通過添加表面活性劑促使酶釋放，從而提高發(fā)酵液中葡萄糖氧化酶的含量，達(dá)到提高總酶活力的目的。由圖5可知，3種表面活性劑對(duì)產(chǎn)酶都有促進(jìn)作用，其中吐溫-80對(duì)產(chǎn)酶的促進(jìn)作用最強(qiáng)。因此選用吐溫-80作進(jìn)一步研究。

圖 5 表面活性劑對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of surfactant type on glucose oxidase production

2.2.2 吐溫-80添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖6可知，吐溫-80添加量為0時(shí)，酶活力為28.60U/mL；隨著吐溫-80添加量的增高，產(chǎn)酶的促進(jìn)效果也增強(qiáng)；當(dāng)添加量為3%時(shí)，酶活力達(dá)到68.96U/mL，約提高了1.4倍?？赡茉蚴翘砑恿窟_(dá)到3%之前，細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的通透性隨著添加量的增高而逐漸增大，在3%附近，菌體產(chǎn)酶達(dá)到最大值。添加量繼續(xù)增大，過大的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁通透性會(huì)影響菌體細(xì)胞的正常生命活動(dòng)。因此，選擇吐溫-80添加量為3%。

2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖 7 黑曲霉H1-9b的產(chǎn)酶曲線Fig.7 Production curve of glucose oxidase

由圖7可知，黑曲霉H1-9b在培養(yǎng)3d時(shí)，達(dá)到產(chǎn)酶高峰，之后酶活力緩慢下降，因此發(fā)酵時(shí)間應(yīng)為3d左右。

3 討 論

影響黑曲霉產(chǎn)葡萄糖氧化酶的因素很多，在液體發(fā)酵狀態(tài)下培養(yǎng)基的組成、發(fā)酵條件等都是重要因素。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)研究不同發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)黑曲霉H1-9b的產(chǎn)酶影響(未發(fā)表)；在此基礎(chǔ)上，本研究對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了正交試驗(yàn)優(yōu)化；之后向培養(yǎng)基添加3%吐溫-80以提高葡萄糖氧化酶產(chǎn)量。優(yōu)化后的發(fā)酵條件為：接種量200μL孢子懸液、裝液量80mL、初始pH5.3、轉(zhuǎn)速200r/min。這時(shí)所獲得的葡萄糖氧化酶總酶活力最高可達(dá)28.60U/mL；當(dāng)在培養(yǎng)基中添加3%吐溫-80后，酶活力提高到68.96U/mL，是未添加吐溫-80發(fā)酵產(chǎn)酶量28.60U/mL的2.4倍，是文獻(xiàn)[8]報(bào)道的4倍。通過發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線得知，黑曲霉H1-9b的發(fā)酵時(shí)間應(yīng)為3d左右。

本研究通過添加表面活性劑吐溫-80[20]的方法，顯著提高了酶產(chǎn)量。這對(duì)小規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)更多的酶有一定的參考價(jià)值。使用吐溫-80具有以下優(yōu)點(diǎn)：屬于非離子表面活性劑，對(duì)菌體的毒性最??；是水溶性長(zhǎng)鏈脂肪酸的酯類物質(zhì)，可影響微生物細(xì)胞的膜通透性[20]及發(fā)酵液的乳化性和分散性，使葡萄糖氧化酶釋放到發(fā)酵液中；分泌到胞外的葡萄糖氧化酶更適合于工業(yè)化大生產(chǎn)和獲得高純度樣品，因?yàn)榘饷甘占奖悖l(fā)酵液中蛋白質(zhì)種類較細(xì)胞內(nèi)部少，從而可以降低后續(xù)純化難度，故可考慮將此方法應(yīng)用于小規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，同時(shí)也為今后研究大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)工藝提供一定的參考。

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