氣體二氧化氯對黃曲霉的抑菌效果研究

楊 莎，白小龍，晉日亞，* ，陜 方，郭凱旋，牛浩剛，吳衛(wèi)東

(1.中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，山西太原030051;2.山西農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，山西太原030031)

谷類農(nóng)作物極易感染黃曲霉菌而發(fā)霉變質(zhì)，尤其是玉米小麥等常食農(nóng)作物。據(jù)報道全世界每年至少有2%的谷物因污染黃曲霉而報廢。由于黃曲霉危害嚴(yán)重［1］，對其的抑菌研究也不勝枚舉，國內(nèi)外學(xué)者對黃曲霉的抑菌研究集中在物理方法抑菌［2-3］和生物制劑抑菌［4-6］方面，此類方法雖然能起到較好的抑菌防霉效果，但成本較高，尤其是生物制劑，很難滿足工業(yè)需求?；瘜W(xué)抑菌法尚停留在對防霉劑的研究上，傳統(tǒng)的防霉劑效果不甚理想且大多數(shù)存在安全隱患。二氧化氯作為聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織(WHO)確認(rèn)的A1 級殺菌消毒劑，以其良好的擴(kuò)散性、穿透性［7］和易降解、無殘留［8］的特點(diǎn)，已經(jīng)在眾多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用［9-10］。本實(shí)驗(yàn)嘗試進(jìn)一步拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域，采用氣體二氧化氯為殺菌防霉劑，對谷物表面的黃曲霉菌進(jìn)行抑菌效果研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃曲霉菌(Aspergillus flavus) 購于山西大學(xué)生物工程系;黃曲霉菌載體 選擇易于感染黃曲霉菌的農(nóng)作物玉米、小麥和小雜糧甜蕎、苦蕎，由山西農(nóng)科院提供，選擇顆粒飽滿，無蟲蛀現(xiàn)象的樣品作實(shí)驗(yàn)樣品;馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA) 馬鈴薯去皮，稱取200g、切成小塊，加蒸餾水煮沸30min，2 層紗布過濾，再加20g 葡萄糖和20g 瓊脂定容至1000mL，于高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌20min。取出后制作平板，冷卻后貯存?zhèn)溆?自制純度為97.3%的高純度二氧化氯氣體、葡萄糖(分析純) 天津市江天化工技術(shù)有限公司;瓊脂粉(生化試劑)、氯化鈉(NaCl，分析純) 天津市大茂化學(xué)試劑廠;無水乙醇(分析純) 天津市北辰方正試劑廠。

ESJ200-4 型電子分析天平 沈陽龍騰電子有限公司;BJ-2CD 型凈工作臺、YXQ-LS-18S1 型自動手提式滅菌器、SPX-250B-Z 型電腦生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;2DHW 型電熱套 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;JB-3 型定時恒溫磁力攪拌器 上海雷滋新涇儀器有限公司;UV-9600 型紫外分光光度計 北京瑞利分析儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃曲霉菌載體的接種 稱取玉米，小麥，甜蕎和苦蕎各80g 并清洗晾干。取黃曲霉的活化斜面若干，在無菌操作條件下，用經(jīng)過灼燒的接種環(huán)將淹沒在1mL 滅菌蒸餾水中的黃曲霉菌落從活化斜面的培養(yǎng)基上刮下來，倒進(jìn)裝有谷物的燒杯中，菌懸液的量以浸沒谷物為準(zhǔn)。充分?jǐn)嚢瑁瑸V去菌液，晾干待用。

1.2.2 抑菌實(shí)驗(yàn)設(shè)計 根據(jù)黃曲霉抑菌的有關(guān)文獻(xiàn)以及預(yù)實(shí)驗(yàn)總結(jié)，設(shè)計二氧化氯抑菌濃度、抑菌時間為主要實(shí)驗(yàn)因素，對二氧化氯濃度和抑菌時間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，確定水平區(qū)間。

1.2.2.1 二氧化氯抑菌濃度測試 稱取染菌小麥6份，各5g，置于六個殺菌消毒柜中，分別接入二氧化氯氣體發(fā)生儀，在抑菌時間40min 的前提下，研究二氧化氯濃度對抑菌率的影響。因低濃度二氧化氯既可高效殺菌又可避免殘留，設(shè)置濃度梯度為0.5、4.5、8.5、12.5、16.5、20.5mg/L 為宜。

1.2.2.2 抑菌時間的測試 稱取染菌小麥6 份，各5g，置于六個殺菌消毒柜中，接入二氧化氯氣體發(fā)生儀，控制抑菌濃度為12.5mg/L，研究抑菌時間對抑菌率的影響。抑菌時間梯度設(shè)置為5、10、20、30、40、50、60min 為宜。

1.2.2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以抑菌率為主要考察指標(biāo)，利用正交法，選擇二氧化氯濃度、抑菌時間和黃曲霉的載體類別為考察因素，每個因素設(shè)置四個水平，選用L16(45)因素水平表安排正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計水平因素見表1 所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素水平設(shè)計Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.3 菌懸液制備 將經(jīng)過二氧化氯殺菌的谷物置于裝有50mL 帶轉(zhuǎn)子的生理鹽水錐形瓶中，調(diào)節(jié)磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為1000r/min，充分離心30min，使得附著于谷物表面的霉菌孢子盡量都溶于生理鹽水中，制成菌體濃度為105CFU/mL 以上的均勻菌懸液。

式中，N0表示處理前菌體的數(shù)量，N1表示處理后菌體的數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 二氧化氯對黃曲霉菌的抑菌濃度單因素實(shí)驗(yàn)

由圖1 所示，隨著二氧化氯濃度的增加，抑菌率逐漸增加，在濃度達(dá)到8.5mg/L 時，抑菌率已經(jīng)達(dá)到97.37%，繼續(xù)增加二氧化氯濃度，抑菌率雖還呈現(xiàn)增長趨勢，但增幅很小。這是由于當(dāng)二氧化氯濃度達(dá)到8.5mg/L 時，對負(fù)載于小麥表面的黃曲霉的抑菌效果已經(jīng)趨于最大值了，小麥表面剩余的少量黃曲霉菌為抗性很強(qiáng)的個體，殺滅較困難，所以繼續(xù)增加二氧化氯濃度對抑菌率的影響不大。由于黃曲霉載體對抑菌率可能存在很大影響，所以選擇二氧化氯濃度區(qū)間范圍為4.5、8.5、12.5、16.5mg/L 為宜。

圖1 二氧化氯濃度對抑菌率的影響Fig.1 Effect of concentration of chlorine dioxide(ClO2)gas on the antibacterial rates

2.2 二氧化氯對黃曲霉菌的抑菌時間單因素實(shí)驗(yàn)

由圖2 所示，隨著抑菌時間的延長，抑菌率增幅明顯，當(dāng)抑菌時間達(dá)到30min 后，抑菌率趨于平穩(wěn)，并在30min 時抑菌率為最大值，繼續(xù)延長抑菌時間對抑菌率影響很小了，考慮其原因可能為在30min，氣體二氧化氯已經(jīng)將絕大部分的黃曲霉菌致死，存活的少量菌種生命力較強(qiáng)，不易致死。繼續(xù)延長殺菌時間沒有意義。所以選擇二氧化氯抑菌時間為10、20、30、40min 為宜。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

按照L16(45)設(shè)計正交實(shí)驗(yàn)表，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2 所示。

為了進(jìn)一步探究實(shí)驗(yàn)因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的顯著性，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析，見表3。

表2 L16(45)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析表Table 2 Result of L16(45)orthogonal test and range analysis

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3 Result of orthogonal analysis of variance

圖2 二氧化氯抑菌時間對抑菌率的影響Fig.2 Effect of the action time of chlorine dioxide(ClO2)gas on the antibacterial rates

根據(jù)表2 極差分析可得，二氧化氯對黃曲霉的抑菌最佳條件為:A4B4C4，即氣體二氧化氯抑菌濃度為16.5mg/L，抑菌時間為40min，黃曲霉載體為苦蕎，此條件下的抑菌率高達(dá)99.99%。從表3 中方差分析可以看出，霉菌載體對抑菌率具有顯著性影響，抑菌時間次之，抑菌濃度的影響不顯著。而當(dāng)霉菌載體為苦蕎時，在正交實(shí)驗(yàn)表中，4、10 號實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果均為99.99%，就能量消耗考慮，優(yōu)于正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出的條件，其中4 號實(shí)驗(yàn)抑菌時間較長，10 號實(shí)驗(yàn)抑菌濃度較高，以經(jīng)濟(jì)有效、合理利用、效率最高為原則，選擇4 號實(shí)驗(yàn)條件，即氣體二氧化氯抑菌濃度為4.5mg/L，抑菌時間為40min，黃曲霉載體為苦蕎作為最優(yōu)工藝條件。玉米和小麥作為易感染黃曲霉的糧食作物，當(dāng)抑菌時間為40min 時，抑菌率也均高于90%。

3 結(jié)論

采用平板涂布法，評價氣體二氧化氯對谷物表面黃曲霉的抑菌效果，以抑菌濃度、抑菌時間和黃曲霉菌的載體為實(shí)驗(yàn)因素，以抑菌率為指標(biāo)，設(shè)計了L16(45)正交實(shí)驗(yàn)，得到以下結(jié)論:氣體二氧化氯對黃曲霉的抑菌效果顯著，最佳抑菌工藝為:當(dāng)霉菌載體為苦蕎時，氣體二氧化氯濃度為4.5mg/L，抑菌時間為40min，抑菌率達(dá)到99.99%。通過正交分析得，三因素的影響顯著性主次順序?yàn)檩d體類別、抑菌時間、抑菌濃度。

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